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肝脏移植中的缺血再灌注损伤是难以避免的,常引起移植术后肝功能衰竭、延迟性肝功能障碍、胆道损伤等多种并发症,因此如何能够减轻移植肝脏的缺血再灌注损伤是肝脏外科领域中的热点问题之一。从20世纪80年代起,国内外的学者做了大量的试验研究,发现了几种能够减轻移植肝脏缺血再灌注的方法,其中最主要的两种方法是缺血预处理(ischemia preconditioning,IPC)和缺血后处理(ischemia postconditioning,IPO)。国内外学者首先发现预先给予肝脏短暂性缺血-再灌注后,能够诱导肝脏产生内源性保护机制,使其对以后较长时间的缺血产生显著的耐受性,在机体内产生一种保护作用,从而提出了缺血预处理的概念。目前关于肝脏IPC机制尚未完全清楚,但越来越多的实验证实,IPC保护涉及许多介质、信号转导途径、效应细胞活化等。由于缺血预处理需在缺血前施予,无法进行有效的预测性及临床可控性,所以其在临床中的应用价值十分有限。随后国内学者又在培养的成年大鼠心肌细胞缺氧-复氧模型中发现,已缺氧心肌细胞在复氧前经多次短暂复氧-停氧处理,可明显提高心肌细胞的存活率,进而提出了缺血后处理的概念。业已证实IPO同样能够在肝脏再灌注损伤动物模型中发挥保护作用。但是IPO的具体保护机制仍不完全清楚,目前有试验证实IPO的保护作用主要发生在缺血后再灌注前2min内,其机理可能与有控制的缓慢间歇性复氧,减少了突然复氧时氧自由基的爆发性产生、刺激胞内抗氧化酶和自由基消除剂的释放、减轻细胞膜的脂质氧化、诱导抗炎性细胞因子表达、减少钙超载、上调抗凋亡基因等因素有关。近来研究发现,血红素氧合酶(Heme oxygenase,HO)是人体内重要的具有保护作用的内源性物质之一,被认为是体内减轻氧自由基损伤强有力的一种酶,是迄今为止发现的生物体内最容易被诱导产生的抗氧化酶,是细胞应激的主要敏感指标之一。目前已知人体内的HO有HO-1、HO-2和HO-3三种同工酶。其中HO-1为其诱导型,其活性可在多种应激因素的诱导下上调。HO-1是催化血红素降解的起始酶和限速酶,催化血红素降解为胆绿素、CO和铁,具有抗氧化功能、维持微循环、调节细胞周期功能、抗炎功能等功能。最近在肝移植缺血再灌注试验中证实,缺血后处理能诱导HO-1过表达,从而使移植肝脏具有很好地抗缺血/再灌注损伤的功效。本论文进一步地探讨HO-1在肝移植缺血后处理中的作用,为后续深入研究缺血后处理保护作用机制和寻找抗肝脏缺血再灌注损伤作用靶点提供理论依据。[目的】1.探讨2min内最佳的缺血后处理时间段。2.探讨缺血后处理对大鼠缺血再灌注损伤肝脏血红素加氧酶-1表达的影响。3.探讨血红素氧合酶-1在大鼠肝移植缺血后处理中的保护作用及可能的机制。【方法】1.在Kamada的二袖套法大鼠肝移植模型的基础上对其进行适当改良,建立改良的大鼠肝移植模型。2.2min内最佳的缺血后处理时间段。(1)动物分组:把176只雄性健康SD大鼠随机分成2h和6h两个部分,每个部分又分成①假手术组,②缺血再灌注组(I/R组),③10s/10s缺血后处理时间段组:门静脉完全再通前,按照再灌注10s,夹闭10 s,④30s/30s缺血后处理时间段组:门静脉完全再通前,按照再灌注30s,夹闭30s,⑤60s/60s缺血后处理时间段组:门静脉完全再通前,按照再灌注60s,夹闭60s,⑥90s/90s缺血后处理时间段组:门静脉完全再通前,按照再灌注90s,夹闭90s。上述后处理组每组循环6次后完全放开。(2)指标检测:分别在肝移植术后2h和6h检测血清肝功能指标;RT-PCR检测肝组织HO-1mRNA,计算HO-1/β-actin辉度值;免疫组化标记HO-1阳性细胞,计算HO-1阳性细胞率;光镜及电镜观察肝组织病理学变化,以此寻找最佳的缺血后处理时间。3.缺血后处理对大鼠缺血再灌注损伤肝脏血红素加氧酶-1表达的影响。(1)动物分组:把56只雄性健康SD大鼠随机分成①假手术组,②缺血再灌注组(I/R组),③60s/60s缺血后处理时间段组:门静脉完全再通前,按照再灌注60s,夹闭60s,循环6次,④CoPP+60s/60s后处理时间段组(联合组):采用门静脉开放前24小时给予大鼠腹腔注射钴原卟啉(CoPP)(5 mg/kg)诱导血红素氧合酶的表达。(2)指标检测:在肝移植术后6h检测血清肝功能指标;RT-PCR检测肝组织HO-1mRNA,计算HO-1/β-actin辉度值;免疫组化标记HO-1阳性细胞,计算HO-1阳性细胞率;光镜下观察肝组织病理学变化,以此观察缺血后处理对大鼠缺血再灌注损伤肝脏HO-1表达的影响。4.血红素氧合酶-1在大鼠肝移植缺血后处理中的保护作用及可能的机制。(1)动物分组:把56只雄性健康SD大鼠随机分成①假手术组,②缺血再灌注组(I/R组),③60s/60s缺血后处理时间段组:门静脉完全再通前,按照再灌注60s,夹闭60s,循环6次,④锌原卟啉Ⅸ(znPP)+60s/60s后处理时间段组(联合组):门静脉开放前24小时给予大鼠腹腔注射锌原卟啉20 mg/kg抑制血红素氧合酶的表达。(2)指标检测:在肝移植术后6h检测血清肝功能指标;RT-PCR检测肝组织HO-1mRNA,计算HO-1/β-actin辉度值;免疫组化标记HO-1阳性细胞,计算HO-1阳性细胞率;检测MDA、SOD、TGF-β1、TNF-α、IL-1的指标;光镜及电镜下观察肝组织病理学变化,以此观察HO-1对缺血再灌注肝脏的保护作用,以及HO-1与TGFβB1、TNF-α、IL-1之间的关系。[结果]1.改良的大鼠肝移植方法能够有效缩短总手术时间和无肝期时间,而术后大鼠生存率与传统的方法无明显差别。2.2min内最佳的缺血后处理时间段:2h和6h两部分各组之间与正常对照组相比,I/R组、10s/10s IPO组、30s/30s IPO组、60s/60s IPO组、90s/90s IPO组转氨酶明显升高(P<0.05),HO-1表达明显升高(P<0.05),肝组织病理损伤加重;6h损伤较2h氨酶明显升高(P<0.05),HO-1表达明显升高(P<0.05),肝组织病理损伤加重;与I/R组相比,10s/10s IPO组转氨酶明显升高(P<0.05),HO-1表达明显升高(P<0.05),肝组织损伤加重,30s/30s IPO组、60s/60s IPO组转氨酶明显降低(P<0.05),HO-1表达明显升高(P<0.05),肝组织损伤减轻,其中60s/60s IPO组较30s/30s IPO组有更好的抗损伤作用,而90s/90s IPO组无统计学差异(P>0.05)。3.缺血后处理对大鼠缺血再灌注损伤肝脏血红素加氧酶-1表达的影响:CoPP干预后,与正常对照组相比,I/R组、60s/60s IPO组、60s/60s IPO+CoPP联合组转氨酶明显升高(P<0.05),HO-1表达明显升高(P<0.05),肝组织病理损伤加重;与I/R组相比,60s/60s IPO组和60s/60s IPO+CoPP联合组转氨酶明显降低(P<0.05),HO-1表达明显升高(P<0.05),肝组织损伤减轻;与60s/60s IPO组相比,60s/60s IPO+CoPP联合组无统计学差异(P>0.05)。4.血红素氧合酶-1在大鼠肝移植缺血后处理中的保护作用及可能的机制:ZnPP干预后,与正常对照组相比,I/R组、60s/60s IPO组、60s/60s IPO+ZnPP联合组转氨酶明显升高(P<0.05),HO-1表达明显升高(P<0.05),MDA、细胞因子(IL-1β、TGF-β1和TNF-α)含量明显升高(P<0.05)、SOD含量明显降低(P<0.05),肝组织病理损伤加重;与I/R组相比,60s/60s IPO组转氨酶明显降低(P<0.05),HO-1表达明显升高(P<0.05),MDA、IL-1β、TNF-α含量明显降低(P<0.05),SOD、TGF-β1含量明显升高(P<0.05),肝组织损伤减轻,60s/60s IPO+ZnPP联合组无统计学差异(P>0.05);与60s/60s IPO组相比,60s/60s IPO+ZnPP联合组转氨酶明显升高(P<0.05),HO-1表达明显降低(P<0.05),MDA、IL-1β、TNF-α含量明显升高(P<0.05),SOD、TGF-β1含量明显降低(P<0.05),肝组织损伤加重。[结论]1.改良的大鼠肝移植模型是一种稳定、可靠、简便的模型,可操作性强。2.2min内最佳的缺血后处理时间段是60s/60s,能够最有效地减轻移植肝脏缺血再灌注损伤。3.采用诱导剂CoPP+60s/60s IPO(联合组)和单独采用60s/60s IPO都具有增加HO-1表达的作用,并且诱导作用相同。4.CoPP的干预能够诱导HO-1的高表达,减轻肝脏缺血再灌注损伤;ZnPP的干预能够抑制HO-1的高表达,增加肝脏缺血再灌注损伤。5.HO-1与炎性细胞因子TGF-β1、TNF-α、IL-1之间关系密切:HO-1表达增高时,抗炎性因子TGF-β1也增高,促炎性因子TNF-α、IL-1降低;HO-1表达降低时,抗炎性因子TGF-β1也降低,促炎性因子TNF-α、IL-1升高,提示HO-1的抗缺血再灌注损伤的作用机制可能与炎性细胞因子的产生有关。