论文部分内容阅读
磷是植物生物膜和核酸的重要组成成分,也是植物生长发育和新陈代谢中所必须的营养元素。自然界中可供植物吸收利用的磷素稀缺,限制了农林生产产量的提升。多方面解析植物磷饥饿胁迫响应机制,从而发掘与利用植物磷匮乏胁迫响应基因,精选或创制磷高效新种质是解决这一难题可行性高的途径。马尾松（Pinus masoniana Lamb.）是我国南方特有的针叶树种之一,因其能产生松脂和用于生产板材、纸张,在林业经济上有十分重要的价值。然而马尾松原产地土壤有效磷匮乏,限制着马尾松生长发育和产量。因此,阐明马尾松抗低磷胁迫响应机制,挖掘磷缺失应答的关键调控因子,提高马尾松对磷素的利用效率、筛选和培育耐低磷胁迫的马尾松新品种具有指导作用,对马尾松产业的长远发展意义重大。本项目结合马尾松表型及部分生理生化指标,通过m RNA与miRNA高通量测序相结合的方法,得到磷饥饿胁迫与正常供磷下马尾松的差异表达m RNA和miRNA,根据m RNA功能和miRNA靶标基因的功能筛选得到可能应答磷饥饿胁迫的Unigenes和miRNAs。从miRNA和m RNA水平阐明马尾松耐低磷胁迫过程中的应答系统,探索马尾松磷饥饿胁迫分子机理。主要结果如下:（1）马尾松幼苗在重度低磷胁迫（0.5 mg/L）下,马尾松的总根长最长,侧根数量最多;并且马尾松根总长度和侧根数量与介质中磷浓度呈负相关。而马尾松嫩枝在磷饥饿胁迫36 d后差异不明显。另外,低磷胁迫下,马尾松全株总磷含量随时间的递增而减少。中度低磷胁迫（2 mg/L）显著低于正常供磷（10 mg/L）,重度低磷胁迫在胁迫36 d前显著低于正常供磷,48 d之后差异不显著。重度低磷胁迫总磷含量高于轻度低磷胁迫总磷含量,在胁迫12 d和60d时差异显著,推测由于重度低磷胁迫下侧根数量及根总长多于轻度低磷胁迫,植物能够从介质中吸收更多磷素,使得重度低磷胁迫植株体内磷含量高于轻度低磷胁迫。（2）转录组分析得出低磷胁迫下差异表达的基因有7049个,其中根中5162个,嫩枝中2955个。在磷缺失胁迫48 d时,差异表达的基因数目最多。通过分析差异表达基因,和磷相关的基因主要集中在:转录因子（WRKY、MYB、b HLH）、SPX、转运蛋白、酸性磷酸酶、激素信号相关基因（生长素和乙烯）和新陈代谢相关基因。如注释为MYB转录因子的Unigene0011607,在胁迫24 d的嫩枝中上调,同时在胁迫36 d和48 d的根中上调。乙烯转录因子Unigene0010383在低磷胁迫24 d嫩枝中下调,36 d根中上调。PHT转运蛋白、SPX基因和酸性磷酸酶基因在磷胁迫过程中全部上调表达。（3）miRNA组分析得出190个miRNAs差异表达,其中地下部分125个miRNAs差异表达,嫩枝中74个miRNAs差异表达。低磷胁迫过程中前两个时期根和嫩枝差异表达的miRNAs数目相当;在低磷胁迫处理48 d时地下部分差异表达的miRNAs约是地上部分的7倍。通过预测miRNAs靶基因功能,挖掘了一批与马尾松低磷胁迫可能相关的miRNAs。如miR164-y在胁迫36 d内在根中上调表达。两个miR169家族成员（miR169-x和miR169-y）在胁迫中被抑制表达。三个miR399家族成员（miR399-x、miR399-y和miR399-z）被低磷诱导表达。（4）克隆获得Pma-miR156前体序列及其靶基因Pm-RANBP1B,并进行遗传转化验证。结果显示,过表达Pma-miR156植株的侧根数量比野生型和过表达Pm-RANBP1B植株侧根数量多,野生型和过表达Pm-RANBP1B植株在正常供磷和中度低磷胁迫下侧根数量差异不明显,重度低磷胁迫下过表达Pm-RANBP1B侧根数量显著多于野生型。表明Pma-miR156上调表达增加侧根的合成,重度低磷胁迫下过表达Pm-RANBP1B增加侧根数量。作为miR156的靶基因之一SPL在抑制侧根发生过程中起作用,推测马尾松miR156调控侧根形成响应低磷胁迫。在重度低磷胁迫下Pm-RANBP1B与侧根的形成有待进一步研究。