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抗冻蛋白(AFP,antifreeze protein)广泛地分布在动物、植物以及微生物中,是生命体抵御外界寒冷环境应激性反应所产生的一种蛋白。抗冻蛋白是一种可以非依数性降低冰点、抑制体系发生重结晶特性的蛋白质。据报道,AFP具有提高产品质量,提高农作物抗寒能力,提高冷冻体细胞存活率等作用,广泛地应用于食品、生物、临床医学和化工等领域。本文选取白斑狗鱼为研究对象,发现白斑狗鱼的鱼皮和鱼肉中存在AFP,并进一步对白斑狗鱼抗冻蛋白进行分离纯化,并研究其理化特性和一级结构。1.本文首先研究了AFP的检测方法文中比较了目前常用AFP的检测方法,发现差热分析仪法(DSC)具有样品用量小、可以精确控制温度、可以获得较为准确结果等优点,因此确定DSC法为本文AFP抗冻活性(THA)的检测方法。还迸一步研究了影响测定结果的各个因素,考察使用DSC法测定THA的稳定性、重复性和精密度,结果显示DSC法测定样品THA具有较高的稳定性、重复性和精密度,其RSD在0.4%以下,相对标准偏差为3.84%。2.白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白(Elm AFP)的分离纯化本文以白斑狗鱼为研究对象,选取鱼肉组织为试验材料,利用单因素实验及响应面分析法对Elm AFP进行分离纯化。试验以鱼肉抗冻蛋白的抗冻活性为响应值,对提取温度、p H值、提取时间和料液比四个因素进行优化。实验结果表明:Elm AFP提取的最佳工艺条件为:温度5.14℃、p H 8.40、提取时间为1.88 h和料液比1:2,此时抗冻活性达到0.0612℃。为检验模型的可靠性,课题组做了验证实验,结果显示抗冻活性为(0.0594±0.0013)℃,与理论预测值基本吻合。经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephadex G-50分子筛层析柱纯化后获得了电泳纯的抗冻蛋白,其相对分子质量约为7.6 KDa,THA大约为(0.052±0.0015)℃。3.白斑狗鱼鱼皮中抗冻蛋白(Els AFP)的分离纯化本文以白斑狗鱼为研究对象,选取鱼皮组织为试验材料,通过单因素及响应面对Els AFP进行分离纯化。以Els AFP的热滞活性作为考察指标,对分离纯化过程中的四个因素(提取温度、提取液的p H值、提取时间和料液比)进行优化。研究表明:在提取温度8℃、提取液p H 8.4、提取时间2 h和料液比1:3.8的工艺条件下,模型预测的热滞活性为0.072℃。经验证实验,发现其热滞活性为(0.069±0.0024)℃,试验值与预测值基本无差异,表明模型具有一定可靠性。另外,通过柱层析对Els AFP进行纯化,纯化后的抗冻蛋白达到电泳级,且其相对分子质量约为6400,热滞活性大约为(0.052±0.0015)℃。4.白斑狗鱼抗冻蛋白的结构鉴定将纯化得到的蛋白质经过HPLC、质谱分析,并使用N-末端测定仪对目标蛋白进行测定。结果显示,分离得到的白斑狗鱼鱼肉抗冻蛋白(Elm AFP)纯度较高,其相对分子质量约为7.4 KDa,N-末端氨基酸序列为LVSLIPIIMPNMVKT;分离得到的白斑狗鱼鱼皮抗冻蛋白(Els AFP)纯度较高,其相对分子质量约为6.3 KDa,N-末端氨基酸序列为MMVFVLLCTQLIPIN。经过同源性分析比较,其与已发现的抗冻蛋白质结构序列具有相似的部分。