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定位重组是由单个多肽酶(重组酶)识别特定的DNA序列(特异性识别位点),并根据特异位点的相对方向对特异识别位点之间的DNA的进行交换、重组、删除与逆转的一种重组系统,整个反应过程可在体外进行且不需要额外能量和辅助因子的参与。本研究拟在该课题前期已建立的通过大规模PCR技术廉价、高效地获得大量线性DNA产物的方法的基础上,利用该系统建立一种新的体外获得环状DNA的方法,即将线性DNA通过定位重组系统转化为环状DNA,为实现高通量离体生产环状DNA提供理论依据。实验结果证实,利用前期已在酵母中表达的DNA聚合酶,我们成功地建立了50ml的PCR体系,通过该方法获得的PCR产物的浓度与常规的方法获得DNA浓度相当；同时将Cre重组酶在大肠杆菌表达系统中成功达,并初步证明纯化后的Cre重组酶具有在体外环化线性DNA的功能。这些结果为进一步实现更大规模的体外生产环状DNA方式奠定了坚实的基础。与传统的通过质粒抽提获得DNA的方法相比,利用大规模PCR和重组酶法获得的环状DNA具备无细菌内毒素和抗生素的污染、成本低、制备周期短等优点,且易删除与表达无关的DNA元件,因此该方法可为无细胞体系快速制备环状DNA开辟了一种新的途径。随后的研究中,我们拟通过大规模PCR的方法制备DNA疫苗,即利用大规模PCR技术获得大量编码某种抗原蛋白的外源基因的“盒式”表达结构产物,经简单纯化后作为线性DNA疫苗直接免疫机体。初步试验结果表明通过本方法获得的线性DNA疫苗具有一定的保护效果,但是与预期的目标还有一定的差距。鉴于环状DNA的稳定性优于线性DNA的,因此拟进一步将线性DNA经重组酶处理后形成环状DNA后作为疫苗免疫机体,检测能否获得更好的保护效果。总之,本研究为快速、大规模制备DNA疫苗迅速应对新发传染病提供了一种新的策略。