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目的：由于原发性肝癌（HCC）存在突变、免疫逃避、抗原性弱、血供丰富等因素导致其死亡率、复发率较高，现有治疗方案并不能改善不能手术的患者的预后。近年来基因疫苗被运用在肿瘤的防治研究上，取得了较大进展，部分肿瘤基因疫苗已经进入临床试验阶段。本实验以与人AFP变化十分近似的小鼠为研究对象，以HCC高表达的肿瘤相关性抗原（Tumor Associated Antigen,TAA）-甲胎蛋白（AFP）作为基因治疗的靶抗原，融合有载体分子效应和佐剂作用的Mt.HSP70的基因，构建融合DNA疫苗，以裸DNA免疫荷瘤鼠以研究该种DNA疫苗的有效性和靶向性；另构建表达mAFP的含荧光蛋白的真核 载体，导入减毒的沙门菌株，以活菌免疫小鼠，研究活菌苗在小鼠体内分布和表达mAFP情况，为进一步研究融合基因疫苗和口服减毒菌苗奠定基础。方法：1．hAFP和mAFP在肝癌细胞中的表达：以RT-PCR方法鉴定所用小鼠细胞系EL4、Hepa1-6及C57BL/6J幼鼠肝脏是否表达mAFP，<WP=10>以HE染色和免疫组织化学法鉴定荷瘤鼠模型是否成功，以免疫组织化学法检测人肝癌组织中hAFP表达情况；2．mAFP与Mt.HSP70融合真核表达质粒的构建和表达： 以RT-PCR方法从Hepa1-6细胞株中获取mAFP基因，应用分子克隆技术构建了系列载体包括pcDNA3.1-AFP、pcDNA3.1-HSP70、pcDNA3.1-AFP -HSP70。经酶切和DNA测序鉴定正确后以脂质体导入COS-7细胞，用RT-PCR和免疫细胞化学检测重组质粒在真核细胞中的表达，将DNA注射小鼠肌肉以免疫组织化学法检测重组质粒在动物体内的表达；3．mAFP与 Mt.HSP70融合真核表达质粒诱导小鼠的免疫应答：免疫前三天以0.25% 布比卡因和0.1%对羟基苯甲酸甲酯多点注射右股四头肌，以重组质粒DNA 100μg 注射小鼠同一部位，一月后加强免疫一次。最后一次免疫2周后取眼眶静脉血测肝功能；分离脾细胞，以ELISA检测经超声破碎的EL4/EL4（mAFP）细胞刺激后分泌的IL-4、IFN-γ，用乳酸脱氢酶释放法（LDH）检测AFP特异性CTL活性。以同样方法免疫Hepa1-6荷瘤小鼠，测量肿瘤大小、观察小鼠存活情况评价重组DNA疫苗抗肝癌作用。4．以减毒沙门菌为载体的mAFP DNA疫苗在小鼠体内的分布和表达：以分子克隆技术构建含荧光蛋白的mAFP真核表达质粒，经酶切鉴定正确后，转染COS-7细胞考查质粒在真核细胞中的表达；电转化减毒沙门菌SL5928(敲除鞭毛)，构建重组活菌苗。体外连续传50代，<WP=11>抽提质粒并酶切鉴定重组菌的稳定性；以多种CFU数灌胃免疫小鼠，观察小鼠生长、精神、腹泻、死亡情况等考查疫苗的安全性；灌胃免疫小鼠后4、7、14、21天取肝、脾、回盲部结肠作冰冻切片，荧光显微镜下观察，考查活菌苗在组织中的表达。结果：1．hAFP和mAFP在肝癌细胞中的表达：小鼠细胞系Hepa1-6、C57BL/6J小鼠肝脏RT-PCR可扩增出预期条带，EL4无目的条带，以Hepa1-6成瘤的肿瘤组织HE染色符合肿瘤组织特征，mAFP染色阳性，人HCC组织标本hAFP染色大部分细胞阳性；2．mAFP与Mt.HSP70融合真核表达质粒的构建和表达：重组质粒pcDNA3.1-AFP、pcDNA3.1-HSP70、pcDNA3.1-AFP-HSP70经酶切和测序鉴定符合Genbank中相应序列，转染细胞后免疫细胞化学染色mAFP和/或HSP70阳性，肌肉注射免疫后肌肉免疫组织化学染色mAFP和/或HSP70阳性；3．mAFP与 Mt.HSP70融合真核表达质粒诱导小鼠的免疫应答：3.1加强免疫后各组小鼠肝功能指标ALB、ALT、AST无统计学差异（p>0.05）；3.2各组脾细胞均未检测到IL-4分泌，经pcDNA3.1-AFP、pcDNA3.1-HSP70、pcDNA3.1-AFP-HSP70免疫的脾细胞受EL4/ EL4(mAFP)刺激后分泌IFN-γ分别为50.18±0.815/123.83±0.815pg/mL，57.65±0.534/35.65±0.815pg/mL，163.32±0.774/197.48<WP=12>±0.815pg/mL，各组分泌的IFN-γ有差别(p<0.05)；3.3效/靶比为25：1时pcDNA3.1-AFP、pcDNA3.1-HSP70、pcDNA3.1-AFP-HSP70三组杀伤率（％）分别4.813±0.259/15.567±0.176、15.590±0.392/15.287±0.425、4.613±0.680/28.983±0.266；效/靶比为50：1时分别为6.447±0.303/17.163±0.162、18.773±0.220/19.287±0.425、6.767±0.231/32.650±0.431。两种效/靶比时，除pcDNA3.1-HSP70组受EL4/EL4(mAFP)刺激的两组间杀伤率无差别外（p>0.05），其余各组间都有差别（p<0.05）；3.4重组质粒免疫Hepa1-6荷瘤7d的小鼠后，荷瘤第28d、35d时， pcDNA3.1-AFP组、pcDNA3.1-AFP-HSP70组肿瘤较PBS组、pcDNA3.1组肿瘤体积小。28d后， PBS组、pcDNA3.1组小鼠开始死亡，至42d两组小鼠全部死亡，共观察80d，pcDNA3.1-AFP-HSP70 组肿瘤较pcDNA3.1-AFP组小。4．含EGFP的mAFP表达载体构建正确，在体外转染真核细胞有表达；将重组质粒电转化导入减毒沙门菌，重组菌在含/不含抗生素的培养基上体外连续传50代，均无质粒丢失；口服免疫小鼠，毒性实验中除操作失误致小鼠死亡外，无明显不良反应；口服后2周内，小鼠肝、脾、结肠LN中均有细菌分布，并且有EGFP的表达。结论：1．Hepa1-6细胞系、C57BL/6J幼鼠均有mAFP表达，EL4中无表达，人HCC中有hAFP表达，选用C57BL/6J作为实验动物、Hepa1-6<WP=13>为荷瘤细胞与人HCC?