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食管癌是人类最常见的六大恶性肿瘤之一，具有显著的地域性分布差异，高低发区发病率相差高达500倍，且预后极差，中晚期患者5年存活率仅为10％。每年全世界新增加的30万患者中有50％发生在中国。河南省林州市及其毗邻的辉县、安阳等地区是中国，也是世界上发病率和死亡率最高的地区，其中男女性年发病率分别高达161／10万，103／10万。贲门癌也是我国北方地区特别是河南林州及安阳等地最常见的恶性肿瘤，并与食管癌地域分布相一致，近二十年来胃远侧肿瘤发生率呈明显下降趋势，而食管和胃交界部腺癌的发生率呈现明显的上升趋势。目前食管癌和贲门癌仍然是该地区居民肿瘤相关死亡的主要原因。多项研究提示食管癌和贲门癌的发生和演变涉及多种染色体异常的积累，这些染色体异常区可能含有与食管癌和贲门癌相关基因。但是，有关河南食管／贲门癌高发区居民食管／贲门癌组织全部基因组变化特征的研究报道甚少。 比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)是一种将原位荧光杂交技术与数字图像分析相结合，用于检测肿瘤组织DNA异常(缺失、扩增、复制)的细胞遗传学技术。利用CGH技术还可获得相应的癌基因扩增或抑癌基因丢失的信息。本研究利用CGH技术，检测食管癌和贲门癌基因组DNA拷贝数的增加(gain)和丢失(loss)的变化特征和规律，寻找和定位与食管和贲门癌变相关的基因，加深对食管癌和贲门癌癌变机制的了解。 Ⅱ．1．1材料和方法 Ⅱ．1．1．1食管癌和贲门癌组织 37例食管癌病人(男18例，女19例，平均年龄56±9岁，年龄范围47～69岁)和30例贲门癌病人(男23例，女7例，平均年龄56±9岁，年龄范围40～74岁)的新鲜标本均来自食管癌高发区河南省林州姚村医院2001年9月至2002年3月间手术病人。术中切除的食管癌标本迅速放入液氮中，之后储存于-80℃冰箱中备用。所有患者术前均未进行过放疗和化疗。食管癌手术切除标本病理学检查证实均为食管鳞状细胞癌，其中高分化8例，中分化21例，低分化8例。贲门癌手术切除标本病理学检查证实均为贲门腺癌，其中高分化6例，中分化和低分 比较基因组杂交：食管癌和责门癌DNA拷贝数的特征化各12例。111二．2 DNA抽提 对癌组织进行冰冻切片，95％的酒精固定，在解剖显微镜下刮片，分离出癌细胞，经此方法，通常可获得切片中80％的癌细胞，应用蛋白酶K／SDS消化刮取的癌细胞，酚／氯仿／异丙醇抽提DNA。正常参照组DNA来自人正常组织胎盘。IJ．l．1．3正常人外周血细胞有丝分裂中期染色体标本的制备 抽取健康男性静脉血sml，每lml加入10mlRPMI二 培养基u0oFBS人PHA 120 nlN8 u g）进行外周血培养＊％CO。培养箱孵育 72小时），培养终止前 30分钟加入秋水仙素 50 u N．5 n g卜用 0．075M KCI低渗液处理 20分钟，使细胞分裂停留在中期，甲醇－冰醋酸（3：1）固定，制成细胞悬液，滴片，自然干燥，37OC孵育3－7天备用。11．1．1．4 CGH分析 共分析37例原发性食管鳞状细胞癌和30例贲门腺癌患者癌组织染色体基因组的变化。CGH的主要工作原理：SpectrumGreen＊UTP标记食管癌和贲门癌DNA，SPedfUInRdA叮P标记正常基因组 DNA，二者以 1＊比例混合后制备成探针，同时与正常人外周血的有丝分裂中期染色体进行原位杂交。在荧光显微镜下肿瘤DNA呈绿色，正常组织DNA呈红色；通过检测两种颜色的荧光强度，根据两种颜色的比率情况来显染色体的结构状况，如发现两种颜色比率改变，则说明该区域存在DNA序列的缺失或扩增。CGH的主要步骤是：应用切曰平移法分别用spectrum－GrenJ叮P和SPectrumMdUT P（Wsls，Dow。rs cove）标记 In g肿瘤组织 DNA和 In g正常参照组 DNA。用标记好的肿瘤基因组 DNA探针和正常参照组探针200fig和10 P g人COt4 溶于10ill杂交缓冲液中（体积分数为 50O／甲胺，ZXSSC，pH7刀）75”C变性 5分钟。制备好的中期分裂像玻片，100 P g／mlRNse处理 37oC ．J’时，70％甲酚胺变性液 75T，变性 5分钟，ZXSSC各5分钟。杂交混合液滴于片上，湿盒内37”C孵育3天。杂交后玻片用0．4。SSC10．3％N’I，40洗液75”C洗片二分钟，然后用ZXSSC／0．l％N－P40室温下洗片2分钟，洗片后用 Ind…的 DAPI 40 p！进行染色。11．l．1．5 CGH图像分析 25郑州大学博士学位论文2003届 应用装有 Sensys相机的 Zeiss Axioplan 2显微镜对杂交的中期染色体进行数字化图象处理。应用 Quips Cm程序（Wsis，Downers Grove，IL）进订图象分析，每一例至少选择5个中期相细胞产生的荧光比率进行综合分析。DNA序列拷贝数增加和丢失的分析阈值分别为肿瘤／正常参照比率＞1．25拷贝数的增加或＜0了5拷贝数的丢失，高拷贝数的扩增为肿瘤／正常参照比率＞二．so。11．1．1．6统计学分析 采用SPSSS．0统计软件处理，组间比较利用卡方检验Fisher精确概率法。检验显著性水