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超级细菌的流行是当前人类面临的重大生存问题。超级细菌的流行与抗生素抗性基因（antibioticresistancegenes,ARGs）的传播与扩散密切相关。已有研究发现重金属的抗性基因与ARGs往往共存于细菌的同一基因遗传元件中（比如质粒、转座子、整合子等），因而重金属可能对耐药细菌及其携带的ARGs也具有选择作用。目前研究主要集中在抗生素对耐药细菌及其ARGs的选择作用上，而重金属对耐药细菌及其ARGs的协同选择作用涉及较少。铜（Cu）、锌（Zn）等重金属由于具有促进生长作用，在我国被当作添加剂普遍添加到禽畜饲料中，且滥用现象较为严重。那么饲料中的重金属对动物肠道及粪便细菌类型及其携带耐药基因有什么影响？这一科学问题值得深入研究，该研究取得的成果有望为控制耐药细菌及ARGs在环境中的转移与扩散提供理论基础。本课题分析了饲料中的铜（Cu）、锌（Zn）重金属对鸡肠道细菌的类群多样性、抗性细菌的数量及其携带的ARGs种类和丰度的影响，并对鸡肠道耐药细菌的抗性基因水平转移特性进行了研究。具体研究内容与结果如下：
1.用分离培养法研究了重金属铜、锌处理对鸡肠道耐药细菌比例的影响。相比对照组，Cu组、Zn组和Cu+Zn组样本的四环素抗性菌的分离率分别升高了30.4%、13.9%、49.7%；氯霉素抗性菌的分离率分别升高了14.9%、11.4%、24.9%；氨苄青霉素抗性菌的分离率分别升高了33.3%、37.4%、37.1%；重金属Cu抗性菌的分离率分别升高了38.5%、37.3%、5.6%；重金属Zn抗性菌的分离率分别升高了15.9%、30.8%、31.4%；Cu组链霉素抗性菌的分离率高出对照组14.4%。除了Zn组和Cu+Zn组对链霉素的抗性菌的分离率低于对照组外，各实验组抗性菌的分离率都要显著高于对照组（P＜0.05）。
2.采用宏基因组测序技术分析了重金属对鸡肠道细菌ARGs的多样性和丰度的影响。在Cu组、Zn组、Cu+Zn组和对照组中分别检测到290、281、290和286个ARGs。在各组中共同存在的268个ARGs中，各类型ARGs占比为β-内酰胺类(15.75%)、四环素类（12.82%）、氨基糖苷类（12.45%）、万古霉素类（12.08%）、多重耐药基因（10.1%）、氯霉素类（9.16%）、喹诺酮类（4.4%）、链阳性菌素（1.83%）、大环内酯类（1.47%）、磺胺类（1.1%）、林可霉素类（1,47%）、多肽类（1.1%）、其他（13.92%）。Cu组有65个ARGs的相对丰度显著高于对照组（P＜0.05），有24个ARGs在对照组的相对丰度显著高于Cu组（P＜0.05），其他无明显差异；Zn组有83个ARGs相对丰度显著高于对照组（P＜0.05），有30个ARGs在对照组显著高于Zn组（P＜0.05）；Cu+Zn组相对丰度显著高于对照组的ARGs有65个（P＜0.05），丰度显著低于对照组的ARGs有35个（P＜0.05）。试验组中部分抗性基因相对丰度高出对照组2至73倍，其中丰度显著增高的前二十的基因是dfra1、ermc、dfra12、mexc、lmra、bl2d_oxai、tet33、aph3ia、vph、mdto、mdtf、tet34、mexd、mdtm、emrd、bl2be_ctxm、mdtl、teta、bl2a_iii、tetk。其中Cu组丰度升高最多的基因有dfra1（42.16倍）、ermc（40.84倍）、dfra12（37.99倍）、mexc（32.83倍）、bl2d_oxa1（25.77倍）、aph3ia（22.28倍）、vph（21.55倍）、mdto（18.69倍）；Zn丰度升高最多的基因有bl2be_ctxm(33.86倍)、emrd（31.83倍）、mexc（32.18倍）、tet34(31.65倍)、mdtm（28.18倍）、dfra1（29.02倍）、mdto（29.54倍）、aph3ia（21.33倍）、mdtl（18.99倍）、mexd(14.88倍)；Cu+Zn组丰度升高最多的基因有dfra12（73.55倍）、dfra1(49.25倍)、mexc（40.4倍）、bl2d_oxa1（38.29倍）、aph3ia（29.93倍）、lmra（24.36倍）、mdto（15.01倍）、vph（18倍）、mdtf（14.91倍）、mdtl（11.88倍）。
3.从门、纲、目、科、属分类水平对四组鸡粪样本中的菌群进行分析，结果显示各组鸡粪样本中菌群种类较多，具有丰富的多样性。在Cu组、Zn组、Cu+Zn组三个重金属处理组中的主要优势菌是大肠杆菌属（Escherichia）与乳酸杆菌属（Lactobacillus），占比分别为Escherichia（38.38%、19.8%、51.17%）、Lactobacillus（22.24%、46.58%、15.02%）；对照组主要优势菌属是乳酸杆菌属（Lactobacillus）（46.53%）和拟杆菌属（Bacteroides）（12.07%）。
4.鸡粪便样品中多重抗性菌的鉴定和质粒上抗性基因分析。从三个实验组鸡粪样品中共分离出9株重金属和抗生素共抗性菌，经16SrRNA比对分析，9株共抗性菌中，有5株是大肠杆菌属，4株是志贺氏菌属。选取各类型共14对ARGs引物和4对重金属抗性基因引物，对所提取的抗性菌质粒进行扩增。结果显示JFB07和JFB09携带其中4个抗生素抗性基因；JFB02、JFB03、JFB05、JFB08携带其中3个抗生素抗性基因；JFB04和JFB06携带其中2个抗生素抗性基因，并且各质粒均携带抗铜或抗锌基因。
5.质粒接合转移试验研究了重金属胁迫选择出的鸡粪共抗性（同时对重金属和抗生素表现抗性）细菌ARGs转移特性。以分离自三个重金属处理组的8株抗性菌为供体菌，大肠杆菌DH5a为受体菌。结果Shigellasp.JFB08和Escherichiasp.JFB09两株菌转移成功，其中JFB08的转移率为26%，JFB09的转移率为1.3%，两株接合子分别提取到与JFB08和JFB09相同片段大小的质粒。
本课题研究结果表明，在重金属铜、锌处理后，鸡粪细菌多样性有着明显改变，细菌整体耐药水平显著提高，部分ARGs丰度明显升高，重金属胁迫选择出的鸡粪共抗性细菌也呈现出转移与扩散的能力。因此，饲料中的重金属添加可以提升鸡粪便细菌的耐药水平，从而加剧细菌ARGs的扩散与转移。本论文的研究结果将为控制细菌ARGs的转移与扩散，防止细菌耐药性的蔓延提供基础。
1.用分离培养法研究了重金属铜、锌处理对鸡肠道耐药细菌比例的影响。相比对照组，Cu组、Zn组和Cu+Zn组样本的四环素抗性菌的分离率分别升高了30.4%、13.9%、49.7%；氯霉素抗性菌的分离率分别升高了14.9%、11.4%、24.9%；氨苄青霉素抗性菌的分离率分别升高了33.3%、37.4%、37.1%；重金属Cu抗性菌的分离率分别升高了38.5%、37.3%、5.6%；重金属Zn抗性菌的分离率分别升高了15.9%、30.8%、31.4%；Cu组链霉素抗性菌的分离率高出对照组14.4%。除了Zn组和Cu+Zn组对链霉素的抗性菌的分离率低于对照组外，各实验组抗性菌的分离率都要显著高于对照组（P＜0.05）。
2.采用宏基因组测序技术分析了重金属对鸡肠道细菌ARGs的多样性和丰度的影响。在Cu组、Zn组、Cu+Zn组和对照组中分别检测到290、281、290和286个ARGs。在各组中共同存在的268个ARGs中，各类型ARGs占比为β-内酰胺类(15.75%)、四环素类（12.82%）、氨基糖苷类（12.45%）、万古霉素类（12.08%）、多重耐药基因（10.1%）、氯霉素类（9.16%）、喹诺酮类（4.4%）、链阳性菌素（1.83%）、大环内酯类（1.47%）、磺胺类（1.1%）、林可霉素类（1,47%）、多肽类（1.1%）、其他（13.92%）。Cu组有65个ARGs的相对丰度显著高于对照组（P＜0.05），有24个ARGs在对照组的相对丰度显著高于Cu组（P＜0.05），其他无明显差异；Zn组有83个ARGs相对丰度显著高于对照组（P＜0.05），有30个ARGs在对照组显著高于Zn组（P＜0.05）；Cu+Zn组相对丰度显著高于对照组的ARGs有65个（P＜0.05），丰度显著低于对照组的ARGs有35个（P＜0.05）。试验组中部分抗性基因相对丰度高出对照组2至73倍，其中丰度显著增高的前二十的基因是dfra1、ermc、dfra12、mexc、lmra、bl2d_oxai、tet33、aph3ia、vph、mdto、mdtf、tet34、mexd、mdtm、emrd、bl2be_ctxm、mdtl、teta、bl2a_iii、tetk。其中Cu组丰度升高最多的基因有dfra1（42.16倍）、ermc（40.84倍）、dfra12（37.99倍）、mexc（32.83倍）、bl2d_oxa1（25.77倍）、aph3ia（22.28倍）、vph（21.55倍）、mdto（18.69倍）；Zn丰度升高最多的基因有bl2be_ctxm(33.86倍)、emrd（31.83倍）、mexc（32.18倍）、tet34(31.65倍)、mdtm（28.18倍）、dfra1（29.02倍）、mdto（29.54倍）、aph3ia（21.33倍）、mdtl（18.99倍）、mexd(14.88倍)；Cu+Zn组丰度升高最多的基因有dfra12（73.55倍）、dfra1(49.25倍)、mexc（40.4倍）、bl2d_oxa1（38.29倍）、aph3ia（29.93倍）、lmra（24.36倍）、mdto（15.01倍）、vph（18倍）、mdtf（14.91倍）、mdtl（11.88倍）。
3.从门、纲、目、科、属分类水平对四组鸡粪样本中的菌群进行分析，结果显示各组鸡粪样本中菌群种类较多，具有丰富的多样性。在Cu组、Zn组、Cu+Zn组三个重金属处理组中的主要优势菌是大肠杆菌属（Escherichia）与乳酸杆菌属（Lactobacillus），占比分别为Escherichia（38.38%、19.8%、51.17%）、Lactobacillus（22.24%、46.58%、15.02%）；对照组主要优势菌属是乳酸杆菌属（Lactobacillus）（46.53%）和拟杆菌属（Bacteroides）（12.07%）。
4.鸡粪便样品中多重抗性菌的鉴定和质粒上抗性基因分析。从三个实验组鸡粪样品中共分离出9株重金属和抗生素共抗性菌，经16SrRNA比对分析，9株共抗性菌中，有5株是大肠杆菌属，4株是志贺氏菌属。选取各类型共14对ARGs引物和4对重金属抗性基因引物，对所提取的抗性菌质粒进行扩增。结果显示JFB07和JFB09携带其中4个抗生素抗性基因；JFB02、JFB03、JFB05、JFB08携带其中3个抗生素抗性基因；JFB04和JFB06携带其中2个抗生素抗性基因，并且各质粒均携带抗铜或抗锌基因。
5.质粒接合转移试验研究了重金属胁迫选择出的鸡粪共抗性（同时对重金属和抗生素表现抗性）细菌ARGs转移特性。以分离自三个重金属处理组的8株抗性菌为供体菌，大肠杆菌DH5a为受体菌。结果Shigellasp.JFB08和Escherichiasp.JFB09两株菌转移成功，其中JFB08的转移率为26%，JFB09的转移率为1.3%，两株接合子分别提取到与JFB08和JFB09相同片段大小的质粒。
本课题研究结果表明，在重金属铜、锌处理后，鸡粪细菌多样性有着明显改变，细菌整体耐药水平显著提高，部分ARGs丰度明显升高，重金属胁迫选择出的鸡粪共抗性细菌也呈现出转移与扩散的能力。因此，饲料中的重金属添加可以提升鸡粪便细菌的耐药水平，从而加剧细菌ARGs的扩散与转移。本论文的研究结果将为控制细菌ARGs的转移与扩散，防止细菌耐药性的蔓延提供基础。