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背景: 幽门螺杆菌(Helicobactor pylori,H. pylori)是一种定植于胃粘膜的螺旋状革兰阴性杆菌,可以引起从胃炎、胃溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤( gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma,MALT)甚至胃癌等一系列的疾病.世界卫生组织在1994年已将幽门螺杆菌确定为胃癌的I类致癌因子.流行病调查显示幽门螺杆菌感染了世界一半以上的人口,在发展中国家尤为严重.细胞毒素相关基因 A (Cytotoxin-associated gene A,CagA)是幽门螺杆菌的主要致病因子,可以通过IV型分泌系统(type IV secretion system,T4SS)注射进入宿主细胞,继而导致一系列病理损伤.研究显示,从西方国家分离的幽门螺杆菌菌株中有约 60%携带 CagA,而绝大部分从东亚国家分离的幽门螺杆菌菌株为CagA阳性.相较于CagA- H. pylori菌株, CagA+H. pylori菌株更容易引起胃粘膜病理损伤,但其免疫学机制尚不明确. 铋剂与抗生素结合的三联疗法是目前治疗幽门螺杆菌感染的主要方法,但这种治疗方法存在容易引起抗生素耐受、病人依从性差、容易复发等缺点.面对病原微生物感染,疫苗可能是最有效的免疫学防治手段.目前,全球已广泛开展幽门螺杆菌疫苗研究,从全菌形式的传统疫苗到亚单位蛋白或 DNA 形式的新型疫苗,类型多样,均存在较好的动物保护效果,但大多数仍处于临床前研究阶段.由第三军医大学研制的口服重组幽门螺杆菌疫苗已完成所有人体临床试验研究并获得国家 1.1 类新药证书,成为全球首个获批的幽门螺杆菌疫苗,大大推动了此类疫苗发展.该疫苗的Ⅲ期临床试验结果表明:第一年的保护率为71.8% (95% CI 48.2–85.6),但第二年却锐减到55.0% (95% CI 0.9–81.0).因此,幽门螺杆菌疫苗的有效性和持久性仍有待于进一步提高. 大量研究结果表明:CD4 T淋巴细胞在抗幽门螺杆菌感染中发挥着重要作用.幽门螺杆菌感染后,其抗原会被以DC细胞为代表的抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)吞噬,经过加工后,将抗原分解为多肽表位并与MHC(人体内为HLA)结合,形成肽-MHC复合物.经MHC-Ⅱ类分子递呈的抗原会激发CD4 T细胞应答.幽门螺杆菌特异性CD4 T细胞在发育过程中,由于微环境的不同会发育成为不同的CD4 T细胞亚群.比如,IFN-γ、IL-12等促进向Th1细胞分化,IL-4等促进向Th2分化,IL-6、TGF-β等促进向Th17分化等.研究证明,Th1和Th17细胞在幽门螺杆菌感染中发挥了主要的保护作用.同时,Th1和Th17细胞应答具有免疫优势现象,即其应答主要集中于病原菌的少数抗原及同一抗原的少数表位.这一抗原或表位被称为优势抗原或优势表位.因而,基于幽门螺杆菌优势抗原特异性Th1和Th17应答的疫苗设计将可能成为幽门螺杆菌疫苗研发的新策略. 幽门螺杆菌激发的保护性CD4 T细胞需要募集到胃粘膜局部才能有效发挥抗幽门螺杆菌感染的免疫保护作用.而在自然感染状态下,幽门螺杆菌激发的免疫应答并不足以有效清除其在胃粘膜的定植,从而使许多幽门螺杆菌感染者几十年或终生都处于带菌状态.由此假设,幽门螺杆菌可能通过某种机制影响或抑制了保护性CD4+CD25- T淋巴细胞向胃粘膜局部的募集,但具体机制仍不清楚.由于趋化因子在T淋巴细胞向感染部位募集中具有重要的趋化作用,而在感染条件下,病原菌可以通过多种机制刺激多种细胞分泌趋化因子,比如胃上皮细胞、单核巨噬细胞、DC 细胞、中性粒细胞、B细胞、NK细胞等,以发挥显著的趋化效应.同时,在幽门螺杆菌激发CD4 T细胞应答的过程中,记忆性CD4 T细胞同时产生.在再次遇到相同抗原刺激时,可以迅速对该病原菌产生更强的应答.因而,记忆性CD4 T细胞对于持久抵抗病原菌感染具有重要意义.根据研究,目前已知的记忆性T细胞可以分为三个亚群:位于二级淋巴组织、血液等处的中心记忆性T细胞(central memory T cells,Tcm),广泛游走于外周组织、血液、脾等处的效应记忆性T细胞(effector memory T cells,Tem)和定植于组织、不参加循环的组织固有记忆性T细胞(tissue-resident memory T cell,Trm).因此,本研究将从趋化因子角度对幽门螺杆菌保护性CD4+CD25- T淋巴细胞向胃粘膜募集现象进行解析,以明确其具体的趋化作用与机制,进而深入揭示胃粘膜 CD4+CD25- T淋巴细胞的免疫表型与功能. 研究目的: 1、基于CD4+ T淋巴细胞优势应答的幽门螺杆菌保护性抗原鉴定与作用机制研究. 研究拟通过建立一套新的免疫优势抗原系统性筛选策略,从幽门螺杆菌千余种抗原中(全基因测序,幽门螺杆菌基因组含有1590个开放阅读框,预测可能编码1091个具有生物功能的蛋白质)筛选出能激发CD4+ T淋巴细胞免疫优势应答的抗原,进而评价和分析其抗感染的免疫保护作用和应答机制,为基于CD4+ T淋巴细胞优势应答的新型幽门螺杆菌疫苗研究奠定理论基础并提供疫苗候选分子. 2、幽门螺杆菌胃粘膜保护性CD4+CD25- T淋巴细胞募集的趋化机制研究. 本研究拟从趋化因子角度对幽门螺杆菌保护性CD4+CD25- T淋巴细胞向胃粘膜募集的现象进行解析,以明确其具体的趋化效应和分子机制;同时,进一步分析此类胃粘膜CD4+CD25- T淋巴细胞的表型特征和免疫功能,为深入理解幽门螺杆菌感染的免疫损伤机制和抗感染应答的保护机制提供新的认识. 研究方法: 1、基于CD4+ T淋巴细胞优势应答的幽门螺杆菌保护性抗原鉴定与作用机制研究. 本研究通过基于分子筛层析和质谱的系统性免疫优势抗原筛选法,鉴定出激发CD4+ T淋巴细胞优势应答的幽门螺杆菌保护性抗原.并通过幽门螺杆菌感染的小鼠模型对其作用机制进行了研究.首先,本研究通过分子筛层析法,将幽门螺杆菌全抗原依分子量大小分成30个不同分子量梯度的抗原组分,依次命名为PC01(Mixed Protein Compnent 01)到PC30.通过3H-TDR掺入法细胞增殖实验,筛选出优势刺激CD4 T细胞增殖的幽门螺杆菌优势抗原组分.并在小鼠体内对该组分进行免疫攻毒保护实验,评价其CD4+ T淋巴细胞(Th1和Th17细胞)应答的水平及免疫保护效果.而后,用高效液相色谱-质谱联用技术,对上述幽门螺杆菌优势抗原组分中具体的蛋白成分进行解析,实施重组表达和制备.体外扩增出幽门螺杆菌优势抗原组分特异性CD4 T细胞系,分别检测和分析优势组分中各抗原特异性CD4+ T淋巴细胞(Th1和Th17细胞)应答水平,进而筛选出激发CD4+ T淋巴细胞(Th1和Th17细胞)应答的免疫优势抗原.继而,在小鼠体内进行进一步免疫攻毒保护实验,对上述幽门螺杆菌免疫优势抗原在体内激发CD4+ T淋巴细胞(Th1和Th17细胞)应答情况及保护功能进行评价.最后,基于上述确定的能够有效激发具有保护功能的Th1和Th17应答的幽门螺杆菌免疫优势抗原设计构建新一代幽门螺杆菌疫苗,并对其保护效果和保护机制进行评价与分析. 2、幽门螺杆菌胃粘膜保护性CD4+CD25- T淋巴细胞募集的趋化机制研究. 本研究依托幽门螺杆菌感染小鼠模型,用蛋白芯片法检测胃粘膜趋化因子表达水平,用基因敲除及细胞共培养法解析幽门螺杆菌通过其毒力因子CagA对CD4+CD25- T淋巴细胞向胃粘膜募集的影响和机制,并通过流式细胞术分析募集至胃粘膜的CD4+CD25- T淋巴细胞的免疫表型特征,以小鼠体内实验明确其免疫功能.首先,本研究用同等菌量、同等方式感染小鼠,制备CagA+H. pylori(表达CagA的H. pylori 11637菌株)和CagA-H. pylori(CagA基因敲除的H. pylori11637菌株)感染小鼠模型.用蛋白芯片法检测24种趋化因子在两组小鼠胃粘膜的表达水平.通过趋化及抗体阻滞实验验证上述差异表达的趋化因子对CD4 T细胞募集的影响.流式细胞仪检测两组小鼠胃粘膜及脾CD4 T细胞表面相应趋化因子受体的表达水平.而后,一方面对该趋化因子在小鼠胃粘膜表达受CagA的影响情况进行研究;另一方面明确表达相应趋化因子受体的CD4 T细胞的表型特征和免疫记忆特性.最后,对特定类型CD4 T淋巴细胞在幽门螺杆菌感染及病理损伤中的作用进行解析. 研究结果: 1、基于CD4+ T淋巴细胞优势应答的幽门螺杆菌保护性抗原鉴定与作用机制研究. 1.1.幽门螺杆菌全菌抗原免疫具有显著保护作用并可以有效激发IFN-γ和IL-17A应答. 1.2.幽门螺杆菌抗原组分PC05为幽门螺杆菌的优势抗原组分,能够更强地刺激CD4 T淋巴细胞增殖. 1.3.幽门螺杆菌优势抗原组分PC05可显著激发小鼠胃粘膜及外周Th1和Th17应答,并有效降低幽门螺杆菌在小鼠胃粘膜的定植量,具有明显的免疫保护作用. 1.4.肌苷5 -磷酸腺苷脱氢酶(inosine 5-monophosphate dehydrogenase,IMPDH)、Ⅱ型柠檬酸合酶(typeⅡ citrate synthase,CSⅡ)和尿素酶B亚单位(urease subunit beta,UreB)为PC05中的免疫优势抗原,可有效激发免疫优势的特异性Th1和Th17应答. 1.5. IMPDH、CSⅡ和UreB具有显著优于混合组分PC05的免疫保护效果:幽门螺杆菌在小鼠胃粘膜的定植量更低,病理损伤更轻.同时,在小鼠体内激发了比 PC05更强的Th1和Th17应答. 1.6.由IMPDH、CSⅡ和UreB组成的三亚单位幽门螺杆菌疫苗Mix5-10-11,可有效清除小鼠胃粘膜幽门螺杆菌定植量,明显减轻胃粘膜病理损伤,发挥了满意的免疫保护效果. 1.7.三亚单位疫苗Mix5-10-11在小鼠胃粘膜局部和外周激发出高水平抗原特异性Th1和Th17应答.同时,Mix5-10-11特异性Th1和Th17细胞过继小鼠后,可有效清除幽门螺杆菌.实验表明:免疫优势抗原组成的三亚单位疫苗Mix5-10-11在小鼠体内通过激发保护性Th1和Th17应答发挥了免疫保护功能. 2、幽门螺杆菌胃粘膜保护性CD4+CD25- T淋巴细胞募集的趋化机制研究. 2.1.与CagA+H. pylori菌株相比,CagA-H. pylori菌株感染小鼠后,胃粘膜局部检测到更低的细菌定植数量和更强的CD4 T淋巴细胞应答. 2.2.在CagA-H. pylori菌株感染的小鼠胃粘膜局部,趋化因子CCL1、CCL3、CXCL2、CXCL5和CX3CL1的浓度水平显著高于CagA-H. pylori菌株. 2.3.体外趋化实验显示:CD4 T细胞可以显著向CX3CL1募集.同时,趋化因子CX3CL1的受体CX3CR1在CagA+H. pylori和CagA-H. pylori感染小鼠外周CD4 T细胞上的表达没有差异,而在胃粘膜CD4 T细胞表面,CagA-H. pylori菌株感染小鼠的CX3CR1表达显著高于CagA+H. pylori菌株.通过抗体中和试验,CX3CR1的抗体中和可以有效阻止CD4 T细胞向趋化因子CX3CL1的趋化效应. 2.4. CagA+H. pylori和CagA-H. pylori分别与胃上皮细胞株AGS和BGC823共培养,CagA+组趋化因子CX3CL1的表达水平明显低于CagA-组.即CagA抑制胃上皮细胞株AGS和BGC823分泌趋化因子CX3CL1. 2.5.幽门螺杆菌感染小鼠的胃粘膜CX3CR1+CD4 T细胞的免疫表型为CD3+CD4+CX3CR1+CD25-CD44+CD69-CCR7-,即为CX3CR1+CD25- CD4 Tem细胞. 2.6. Pearson相关性分析显示,幽门螺杆菌感染小鼠胃粘膜CX3CR1+CD25- CD4 Tem细胞数量与幽门螺杆菌定植量和病理损伤程度均呈现负相关关系,而病理损伤程度与幽门螺杆菌定植量呈正相关.即CX3CR1+CD25- CD4 Tem细胞在幽门螺杆菌感染中具有免疫保护作用. 研究结论: 1、IMPDH、CSⅡ和 UreB 为幽门螺杆菌中免疫优势的保护性抗原,可通过激发特异性Th1和Th17细胞优势应答发挥抗幽门螺杆菌感染的免疫保护作用. 本研究建立了基于分子筛层析和质谱分析的优势抗原筛选新策略,并从幽门螺杆菌全抗原中(幽门螺杆菌基因组1590个开放阅读框,预测可能编码1091个具有生物功能的蛋白质)成功筛选鉴定出三个免疫优势抗原IMPDH、CSⅡ和UreB.其中UreB与此前报道相同,得到了进一步验证;IMPDH和CSⅡ为两个新发现的幽门螺杆菌抗原.由这三个免疫优势抗原组成的三亚单位幽门螺杆菌疫苗在小鼠体内具有满意的保护效果.并由此证明免疫优势抗原特异性Th1和Th17细胞在幽门螺杆菌感染中发挥保护作用.该疫苗候选抗原的筛选是基于Th1和Th17细胞应答,是幽门螺杆菌疫苗研发中区别于体液应答的一个成功尝试.这项研究既成功筛选鉴定出了基于CD4+ T淋巴细胞优势应答的幽门螺杆菌保护性抗原,为进一步幽门螺杆菌表位疫苗和多亚单位的研发打下了基础,为其它病原菌疫苗候选抗原的筛选和疫苗研发提供了参考;也在机制上证明了幽门螺杆菌免疫优势抗原特异性Th1和Th17细胞在幽门螺杆菌感染中发挥了重要的保护作用. 2、幽门螺杆菌毒力因子CagA通过CX3CL1/CX3CR1途径抑制保护性CD4+CD25-效应记忆T细胞向小鼠胃粘膜募集. 本研究发现,与CagA+H. pylori相比,更多的保护性CD4+CD25- Tem向CagA-H. pylori感染小鼠胃粘膜募集.这种募集是通过胃上皮细胞分泌趋化因子CX3CL1和CD4+CD25- Tem上调表达趋化因子受体CX3CR1实现的.同时,胃上皮细胞分泌趋化因子CX3CL1可以被幽门螺杆菌毒力因子CagA所抑制.本研究从理论上证明了CD4+CD25- Tem经由CX3CL1/CX3CR1通路向胃粘膜募集.CagA+H. pylori可能通过抑制CD4+CD25- Tem经由CX3CL1/CX3CR1通路向胃粘膜的募集而减轻免疫杀伤、利于自身定植.这为CagA+H. pylori比CagA-H. pylori更容易引起较重的病理损伤提供了新的免疫学机制解释.为幽门螺杆菌的免疫治疗提供了新的参考.研究还证明CD4+CD25- Tem在幽门螺杆菌感染中具有保护作用,为基于CD4 T细胞的幽门螺杆菌疫苗研发提供了新启示.