研究目的:对我所合成的选择性ETA受体拮抗剂,进行抗肺动脉高压和抗右心衰竭的药效学评价,为研发具有自主知识产权的,结构新颖的创新药物提供实验依据,并为选择性ETA受体拮抗剂治疗右心衰竭机制的研究提供有参考价值的实验数据。研究方法:1、肺动脉高压模型:采用低压氧仓(模拟海拔5000米),慢性缺氧(2周)诱导大鼠肺动脉高压;用肺动脉插管与多导生理记录仪监测肺动脉压力和心率;用血细胞分析仪监测血液中红细胞、白细胞、血红蛋白、血小板的变化;通过计算右心指数测量右心室肥厚;用放射免疫方法检测血浆及肺组织中ET-1的含量;用组织病理学检测方法观察肺血管形态学的变化。2、右心衰竭模型:采用野百合碱(60 mg/kg,sc)或低压缺氧诱导大鼠右心衰竭模型,以右心室压力、每搏输出量、右心室肥厚和血液指标的变化为依据,观察缺氧不同时间对大鼠右心功能的影响,以此选择合适的诱导方式和最佳的检测时间,并在该模型上评价药物抗右心衰竭的作用。3、在右心衰竭模型形成的不同时期,采用real-time PCR和Western Blot方法测定肺和心肌组织ETAR的表达,用放免法检测ET-1及BNP含量;在原代培养乳鼠心肌细胞上,采用ET-1诱发心肌细胞肥大模型,通过Western Blot方法测定ETAR的表达情况,通过上述指标的变化分析选择性ETA受体拮抗剂抗右心衰竭的可能机制。研究结果:1、大鼠肺动脉高压模型建立:连续缺氧2周,大鼠SPAP、DPAP和MPAP分别升高了64.6%、34.6%和51.9%,右心指数升高58.3%,肺组织中ET-1的含量升高了75.3%,表明肺动脉高压模型建立成功。2、YJ007抗肺动脉高压的作用药效评价:YJ007是新合成的肽类化合物,由3个氨基酸组成的小肽,对ETA受体具有高亲和力、高选择性的拮抗效应。在缺氧诱导的大鼠肺动脉高压模型上,预防给予YJ007 10 mg/kg sc、20 mg/kg sc、40 mg/kg sc,twice/day,能够剂量依赖性地降低缺氧大鼠肺动脉血压,其中,40mg/kg组显著降低肺动脉收缩压、舒张压和平均压,抑制率分别为53.77%、35.44%和48.71%,与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)。YJ007 20 mg/kg sc和40 mg/kg sc组能够降低右心指数,抑制率分别为15.29%和21.02%,但与模型组相比无显著差异。YJ007 40 mg/kg组能够显著抑制缺氧诱导的肺组织中ET-1含量的升高(P<0.05)。此外,YJ007还能够一定程度的缓解肺血管壁的增厚,降低红细胞及血红蛋白数量,升高血小板数量,但在给药过程中皮肤刺激性较大,注射部位出现多处结节、溃烂及皮肤粘连。3、野百合碱(MCT)诱导的大鼠右心衰竭模型的建立:给予大鼠MCT 60 mg/kg sc,分别在4 w、5 w、6 w观察,发现在右心衰竭形成中动物逐渐出现饮食及活动量减少,精神不振,脱毛,呼吸困难,体重减轻等症状。模型4 w和5 w组大鼠右心室内收缩压较正常大鼠分别升高53.3%和111.98%,舒张压分别升高了19.6%和85.9%,而模型6w组心衰严重,动物死亡率达80%。各模型组大鼠的右心指数均显著高于正常大鼠,分别增加了133.67%、62.24%和174.83(P<0.001),右心室肥厚程度明显。总体评价,MCT能够诱导大鼠右心衰竭,但动物状态很差,肝毒性明显,个体差异较大。4、缺氧诱导的右心衰竭模型建立:大鼠分别缺氧3 w、4 w、5 w,随缺氧时间延长同样出现了饮食及活动量减少,皮毛疏松无光泽,呼吸困难,体重减轻等症状。模型各组大鼠的肺动脉收缩压分别升高了44.2%、83.3%和53.8%,舒张压分别上升了57.3%、94.2%和89.2%,平均压分别上升49.4%、87.6%和67.6%,均具有显著差异(P<0.05)。各模型组动物的每搏输出量与正常大鼠比分别下降了59.84%、50.56和67.67%(P<0.01),右心指数分别升高了84%、112%和108%(P<0.001);此外,各模型组大鼠红细胞数量升高(51.3%~69.1%),血红蛋白数量升高(64.3%~101.1%),血小板数量降低(39.8%~50.7%),血浆中BNP含量升高(79.4%~134.5%),血浆及肺组织中ET-1含量增多(129.7%~252.4%和30.8%~92.8%)等。该模型稳定,各指标变化符合心衰标准,比较适用于药效评价。5、YJ009抗右心衰竭药效评价:YJ009与YJ007是同系化合物,但其抗肺动脉高压作用的强度优于YJ007,对皮肤刺激性明显小于YJ007,所以选择YJ009进行抗心衰作用的研究。首先,用抗ET-1诱发大鼠血压升高的试验,确定YJ009的剂量效应关系,选择能明显对抗ET-1诱导大鼠颈动脉平均压升高(抑制率为40.7%)的剂量40 mg/kg sc作为抗心衰研究的最佳剂量。在缺氧诱导的大鼠右心衰竭模型上,YJ009预防给药(40 mg/kg,sc,twice/day)能显著抑制肺动脉高压,与模型组比较SPAP、DPAP和MPAP分别下降72.58%、71.05%和71.98%(P<0.05);能够降低右心指数,抑制率为26.42%(P<0.05);降低红细胞和血红蛋白数量(53.9%和39.2%),使血小板数量恢复至正常(P<0.05)。YJ009还具有增加每搏输出量、降低血浆中BNP含量及肺组织中ET-1含量的趋势,但因动物数较少(8只/组),个体差异较大,与模型组相比没有显著差异。6、YJ009抗右心衰竭作用的机制研究:通过实时定量PCR试验发现,模型组大鼠肺组织中ETA mRNA表达显著升高,与正常大鼠相比升高了82.4%(P<0.05),YJ009能抑制缺氧导致的ETA mRNA表达升高(抑制率为41.6%)(P<0.05);此外,模型组大鼠心脏中ETA mRNA表达较正常大鼠也有一定程度的升高,但随着缺氧时间的延长,其表达量有所下降,YJ009不能抑制缺氧导致的ETA mRNA表达升高。Western blot结果显示,在肺组织中,模型组大鼠ETAR表达显著升高,与正常大鼠相比升高了213.4%(P<0.001),YJ009组大鼠ETAR表达显著高于正常大鼠,与模型组大鼠表达相当;在心脏中,模型组大鼠ETAR表达升高,YJ009组表达高于正常大鼠,略低于模型组。为进一步确定YJ009对ETAR表达的影响,选择在体外培养的心肌细胞上,给予不同浓度的ET-1(1 nM、10 nM、100 nM)刺激24 h,细胞上ETAR的表达升高,其中ET-1 100 nM组较正常心肌细胞ETAR的表达量显著升高(P<0.05);YJ009能够剂量依赖性的抑制ET-1引起的心肌细胞ETAR表达的增高,但因样本量小(n=4)与ET-1组比较没有显著差异。结论:1、选择性ETA受体拮抗剂YJ007能有效对抗缺氧诱导的肺动脉高压,但与同系物YJ009比较,YJ007对肺动脉血压和右心指数的抑制率低于YJ009,而皮肤的刺激性高于YJ009。2、用野百合碱和缺氧诱导均能建立右心衰竭模型,综合分析,野百合碱具有一定的肝毒性,模型制备不稳定,个体差异大。缺氧诱导4周的右心衰竭模型稳定,方法简单可控,适合作为建立右心衰竭模型的条件。3、YJ009(40 mg/kg,sc)具有对抗右心衰竭的作用,能够显著抑制肺动脉血压的升高、改善右心指数,增加每搏输出量和降低BNP含量,能够一定程度上延缓心衰的形成。4、YJ009抗右心衰竭的作用机制可能与抑制ETAR的表达和功能相关。