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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV2)是圆环病毒科的成员,基因组为1768nt或1767nt,有3个ORFS。ORF1编码复制蛋白Rep, ORF2编码有免疫原性的衣壳蛋白Cap, ORF3编码蛋白可诱导凋亡。PCV2对猪的致病性主要表现为免疫系统损伤,可以引起淋巴结肿大、淋巴细胞减少等病变,使感染猪处于免疫抑制状态,与断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的发生密切相关,给养猪业造成巨大经济损失。尽管PCV2感染后淋巴细胞减少甚至消失的机制尚有争论,但研究表明淋巴样组织被组织细胞取代可能与PCV2诱导凋亡有关。自噬在病毒感染过程中起重要的作用,一方面,自噬可通过降解病毒成分递呈抗原,激活先天免疫,从而达到清除病毒的目的；另一方面,病毒也演变机制逃逸自噬的清除,维持自身存活和复制。研究表明,自噬和凋亡过程可相互调节,凋亡可能和自噬共存在或两者之间存在着一种相互转换关系影响了病毒的感染过程。我们推测PCV2感染可能通过自噬途径导致细胞凋亡,从而引起组织病理学变化和免疫系统损伤。但有关PCV2诱导上述细胞反应及PCV2感染淋巴组织的病理学机制还有待深入研究。本研究旨在探明(1)PCV2感染和细胞自噬之间的关系,影响自噬的关键病毒蛋白；(2)自噬对病毒复制的影响；(3)PCV2引起细胞自噬的信号传导途径及其关键信号分子。1. PCV2感染PK-15细胞后,通过激光共聚焦、免疫印迹和电镜技术分析PCV2与自噬之间的关系。结果表明,与未感染细胞相比,PCV2感染可诱导细胞中eGFP-LC3点的聚集(代表自噬囊泡)(4.33vs27.51, P<0.01).提高了LC3-II/B-actin的比率(24h:1.00vs2.97, P<0.05;36h:1.29vs4.11, P<0.01),电镜结果也表明PCV2感染可诱导自噬泡的形成,说明PCV2感染可诱导PK-15细胞自噬。PCV2感染导致p62蛋白的降解,且在自噬溶酶体抑制剂氯喹存在的情况下,p62和LC3-Ⅱ蛋白水平显著高于(p62：0.83vs1.87,P<0.05；LC3-Ⅱ：2.02vs6.97,P<0.05)未处理组,说明PCV2感染加速了自噬底物的降解。LysoTracker或LAMP1和LC3共定位试验发现,PCV2感染促进了两者的共定位,说明PCV2感染诱导自噬溶酶体的形成,即诱导了完整自噬反应。利用病毒编码蛋白和截短表达载体转染PK-15细胞,激光共聚焦和免疫印迹结果表明,PCV2Cap蛋白能诱导自噬,并且其90-233位氨基酸是诱导自噬的关键区域。2.用不同自噬阶段的抑制剂或诱导剂研究自噬过程对PCV2复制和Cap蛋白表达的影响。荧光定量和TCID50结果表明,不同自噬阶段的抑制剂抑制自噬后均显著降低了PCV2的复制(荧光定量：3-甲基腺嘌呤(3-MA):71.51vs8.96,P<0.01;氯喹(CQ):71.51vs2.74, P<0.001; siAtg5:14.78vs6.24, P<0..05; TCID50:3-MA:4.66vs3.69, P<0.01; CQ:4.66vs3.56, P<0.01; siAtg5:4.2vs3.3, P<0.05)和Cap蛋白的表达；相反,自噬的诱导增强了PCV2的复制(荧光定量：雷帕霉素(Rapamycin):3.52vs23.19, P<0.05;饥饿培养基(EBSS):3.52vs130.65, P<0.05; TCID50:Rapamycin:4.66vs5.09, P<0.05; EBSS:4.66vs5.13, P<0.05)和Cap蛋白的表达,说明自噬有利于PCV2复制。3.许多信号通路能调节自噬过程。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是调节自噬最主要的蛋白,许多激酶,诸如：AMP激活蛋白激酶(AMPK)、胞外信号调节因子(ERK1/2)、肿瘤结节蛋白(TSC2)等是mTOR的上游调节因子。利用免疫印迹、免疫共沉淀和激光共聚焦技术分析PCV2感染诱导自噬形成的机制。结果表明,PCV2感染抑制mTOR并激活ERK1/2途径；UO126或siERK1/2处理PK-15细胞下调ERK1/2,可恢复mTOR的磷酸化水平,抑制自噬。此外,compound C (AMPK抑制剂)处理抑制了ERK1/2、TSC2的磷酸化水平和LC3-Ⅱ蛋白水平,但恢复了mTOR的磷酸化水平；UO126处理也抑制TSC2的磷酸化水平,但并没有抑制AMPK的磷酸化水平。siTSC2处理没有抑制AMPK和ERK1/2的磷酸化水平,但恢复了mTOR的磷酸化水平,抑制自噬。共免疫沉淀结果表明,ERK1/2-AMPK、ERK1/2-TSC2是互作的。以上研究结果表明,PCV2感染可通过AMPK/ERK/TSC2/mTOR信号途径激活自噬,为进一步研究PCV2的感染特性以及致病机制提供了重要的理论基础。综上所述,本研究阐明了(1)PCV2感染诱导PK-15细胞自噬,且Cap蛋白的90-233位氨基酸是诱导自噬的关键区域；(2)自噬过程有利于PCV2复制；(3)PCV2可通过AMPK/ERK/TSC2/mTOR信号途径激活自噬。研究结果为深入研究PCV2的致病机制、探寻抗PCV2药物筛选的靶标奠定基础。