[目的]建立人-大鼠嵌合体肝脏模型,探索植入hUCMSC在新生大鼠出生后不同时间点肝内的生存和变化规律,检测外周血T淋巴细胞比例的变化,探索嵌合状态下免疫耐受形成的可能机制,为脐带间充质干细胞临床应用提供更多理论支持和实验依据。[方法]1.hUCMSC的分离、培养与鉴定:采用微组织块反复贴壁法,即用含10%FBS的DMEM-F12培养液从脐带微组织块中分离培养细胞,并用显微镜观察培养细胞的形态特征、用流式细胞分析技术鉴定培养细胞的免疫表型、用体外诱导分化方法鉴定培养细胞的分化潜能。2.hUCMSC的标记:采用携带绿色荧光蛋白基因(GFP)的慢病毒载体液与hUCMSC共培养,然后用荧光显微镜观察证实GFP的标记情况。3.SD胎鼠内hUCMSC的注射:阴栓观察法确定SD大鼠孕龄,开腹暴露子宫并直接注射hUCMSC到每只胎鼠肝脏,待胎鼠出生后,适时采集肝脏组织和外周血用于鉴定分析。4.嵌合体肝脏鉴定:胎鼠出生后,适时采集肝脏组织制作切片,制作冰冻切片在荧光显微镜下观察植入细胞的分布;制作石蜡切片,应用免疫组化染色法鉴定植入细胞的分化。5.肝脏HE染色分析:胎鼠出生后,适时采集肝脏组织制作切片并用HE染色,显微镜下观察组织学变化。6.T细胞亚群比例测定:胎鼠出生后,适时采集外周血采用流式细胞分析技术检测T细胞亚群比例的变化。[结 果]1.采用组织块反复贴壁培养的技术方法,运用含10%FBS的DMEM-F12培养液静置培养10-12天,可以观察到从剪碎后的脐带微小组织块周围长出贴壁且似旋涡状生长的成纤维样细胞,组织块再次贴壁后2-3天就可见成纤维样细胞爬出。传代培养至第3代时,分离培养的细胞表型CD105、CD13、CD90和CD29表达高,几乎不表达CD34。体外特定诱导分化实验证实:分离的细胞可诱导向脂肪、软骨和骨组织分化。2.按照转染复数(MOI)为50的剂量,将携带GFP的慢病毒转染液和hUCMSC共培养72h后,在荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光,说明hUCMSC 成功标记为 GFP-hUCMSC。3.雌雄大鼠交配结合阴栓观察,可以确定SD大鼠的怀孕龄。在镇静或轻度麻醉下开腹暴露孕鼠子宫,直接注射0.1-0.2mL生理盐水悬浮的106个GFP-hUCMSC到每只胎鼠腹腔或肝脏内,胎鼠的自然分娩率可达60%以上。4.采集出生45天、75天、120天的大鼠肝脏组织,制作冰冻切片,可在荧光显微镜下可观察到绿色荧光信号分布,但120天的大鼠只能观察到极少量绿色荧光分布甚至完全观察不到,在相应的肝脏石蜡切片中,在出生45天和75天的肝脏组织中检测到人肝细胞相关蛋白HNF4α、HNF3β和ALB的表达,出生120天的大鼠肝脏组织中几乎检测不到相关蛋白的表达。GFP信号和HNF4α、HNF3β和ALB的分布呈现随着大鼠成长时间延长而减少的趋势。5.出生45天、75天、120天的大鼠肝脏组织内没有发现明显的炎性细胞浸润、肝细胞坏死等组织学改变。6.采集出生45天、75天、120天的大鼠外周血,检测T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、Treg(CD4+CD25+Foxp3+)的比例,结果显示:注射细胞的三个组大鼠外周血T淋巴细胞亚群比例明显不同于对照组,出生后45天、75天和120天以及对照组的大鼠CD3+细胞比例依次为:44.08±3.02、58.09±3.39、48.18±4.75 和 37.25±3.21,CD4+细胞比例依次为:29.57±1.38、36.61±2.51、32.64±2.58 和 24.19±0.96,CD8+细胞比例依次为:16.56±1.00、24.76±1.60、18.04±1.19 和 11.03±1.05,Treg 细胞比例依次为:2.81±0.18、0.99±0.20、3.59±0.23和1.48±0.24。T淋巴细胞亚群比例的变化趋势与新生大鼠成长时间有关。[结论]1.采用组织反复贴块法,可以从人脐带中分离出hUCMSC,与携带GFP慢病毒载体液共培养,可以成功实现GFP转染标记。2.在开腹直视下注射GFP-hUCMSC到SD胎鼠腹腔甚至肝脏,可以建立人-大鼠嵌合体肝脏模型。新生大鼠生长75天后其肝脏内还可以检测到GFP信号的存在和人肝细胞相关蛋白HNF4α、HNF3β、ALB的表达,但成随着生长时间延长而逐渐减少的趋势。3.胚胎期注射GFP-hUCMSC后出生的大鼠,外周血T细胞亚群比例随着大鼠成长而呈现的规律性变化,可能是免疫耐受相关调控因素共同作用、导致其肝脏内嵌合的人源细胞逐渐减少。