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【目的】为明确Cofilin-2基因与鼻咽癌放射抗拒的关系,本研究应用RNA干扰技术构建稳定的Cofilin-2基因沉默CNE-2R细胞模型,通过细胞体内、外的功能学实验探讨沉默Cofilin-2对CNE-2R细胞放射敏感性的影响,明确Cofilin-2是否可以作为预测鼻咽癌放射治疗反应的蛋白标志物及潜在的治疗靶点,并进一步通过人类基因表达谱芯片,测序分析Cofilin-2沉默后引起CNE-2R细胞的基因表达谱的改变,初步探讨Cofilin-2参与鼻咽癌放射抗拒的机制及通路。【方法】1.针对Cofilin-2设计并合成3条干扰靶点,筛选最佳沉默片段进行慢病毒包装转染鼻咽癌CNE-2R细胞,并分选获得稳定沉默Cofilin-2基因的鼻咽癌CNE-2R细胞模型;采用q RT-PCR及Western-blot实验检测其m RNA及蛋白水平的表达情况,验证干扰效果。2.选用转染效果最好的Cofilin2-RNAi-LV3细胞株作为实验组,通过CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术观察沉默Cofilin-2基因后鼻咽癌CNE-2R细胞的增殖,周期分布、凋亡的变化情况,探讨Cofilin-2与鼻咽癌放射敏感的关系。3.通过裸鼠成瘤实验探讨体内沉默Cofilin-2对人鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R的影响。4.采用ELISA和免疫组化检测Cofilin-2在人鼻咽癌血液及组织中表达情况。5.通过人类基因表达芯片测序分析Cofilin-2沉默后引起CNE-2R细胞的基因表达谱的改变,并运用q RT-PCR及WB初步验证Cofilin-2参与放射抗拒的相关通路。【结果】1.本阶段研究运用慢病毒sh RNA载体转染CNE-2R细胞后,在倒置荧光显微镜下观察各组感染效率均在90%以上,通过q RT-PCR筛选出三个靶点中最佳干扰靶点Cofilin2-RNAi-LV3,Western blot也验证了最佳靶点Cofilin2-RNAi-LV3的抑制效果。2.本阶段CCK-8实验结果显示:Cofilin2-RNAi-LV3组细胞在2、4、6、8、10Gy剂量下的存活率均低于未转染CNE-2R组和阴性对照NC组(F=105.641~153.373,p<0.05),提示Cofilin-2沉默后可增强放射线对CNE-2R细胞增殖的抑制作用。克隆形成实验结果显示:CCofilin2-RNAi-LV3组的存活曲线在2、4、6、8、10Gy剂量均低于未转染CNE-2R组和阴性对照NC组;Cofilin2-RNAi-LV3组的Dq、SF2值均小于未转染CNE-2R组、阴性对照NC组(p<0.05);提示沉默Cofilin2可提高鼻咽癌CNE-2R细胞对放射线的敏感性。细胞周期结果显示:未转染CNE-2R组、阴性对照NC组和Cofilin2-RNAi-LV3组细胞在G2/M期的分布分别为(11.40±1.82)%、(11.91±2.12)%和(39.69±2.89)%,Cofilin2--RNAi-LV3组细胞在G2/M期的比例明显高于未转染CNE-2R组和阴性对照NC组(F=146.016,p<0.05)。细胞凋亡实验结果显示:Cofilin2-RNAi-LV3组、未转染CNE-2R组和阴性对照NC组的凋亡率在0Gy照射时分别为(15.90±0.17)%、(10.60±1.71)%、(10.60±1.71)%,照射10Gy射线时凋亡率分别为(34.00±0.89)%、(20.53±1.89)%、(20.60±1.21)%,在0、10Gy射线照射下,Cofilin2-RNAi-LV3组细胞的凋亡率均高于未转染CNE-2R组和阴性对照NC组(F=26.061、92.496,p<0.05),表明在相同剂量照射下,Cofilin2沉默可以促进CNE-2R细胞凋亡。3.裸鼠成瘤体内实验结果显示,经10Gy射线照射后Cofilin-2沉默组移植瘤体积241.00±53.02小于未照射组的移植瘤体积509.80±55.57,差异有统计学意义(F=20.341,p<0.05);与未转染CNE-2R组和阴性对照NC组比较,Cofilin2-RNAi-LV3组移植瘤的生长减缓明显;此外我们还采用WB及IHC检测各组裸鼠移植瘤Cofilin-2蛋白的阳性表达,与未转染CNE-2R组及阴性对照NC组比较,其表达与体外功能验证一致,提示慢病毒介导Cofilin-2-RNAi干扰载体在体内仍能稳定遗传,并高效表达。4.ELISA及IHC检测35例放射敏感及放射抗拒患者的组织及血清中Cofilin-2蛋白的表达情况,发现Cofilin-2蛋白在人鼻咽癌放射抗拒组者血清和组织中的均高表达,提示它是鼻咽癌放射抗拒蛋白,可作为预测鼻咽癌放疗反应的分子标志物。5.本部分实验通过人类基因表达谱芯片(Affymetrix),测序分析Cofilin-2沉默后引起CNE-2R细胞的基因表达谱的改变,我们发现存在差异表达的基因共874个,其中503个基因表达上调,371个表达基因下调;通过富集和聚类发现差异基因主要和Rho A Signaling、EMT Pathway和TP53Signaling等信号通路相关;进一步采用WB试验检测通路相关蛋白的表达情况,与阴性对照NC组比较,在CNE-2R细胞沉默Cofilin-2能抑制Rho A通路相关蛋白Rho A、Limk1、RND3、PKN1的表达;促进EMT相关通路蛋白CDH1表达上调、抑制CDH2、VAV2、SNAI2、AKT1、EGFR的表达;同时抑制TP53相关通路蛋白TP53、MDM2、BCL2、THBS1、HIF1A的表达。【结论】本研究通过沉默Cofilin-2在CNE-2R细胞中的表达,发现沉默Cofilin-2可抑制射线照射后的CNE-2R细胞的增殖,增强其放射敏感性,可能与细胞受照射后促进CNE-2R细胞凋亡及诱导G2/M期阻滞有关;并且接种沉默Cofilin-2的CNE-2R细胞的裸鼠体内肿瘤组织生长在射线照射后也受到抑制;Cofilin-2蛋白在人鼻咽癌放射抗拒组患者血清和组织中均高表达;此外,通过人类基因表达芯片测序分析沉默Cofilin-2后CNE-2R细胞的基因表达谱的改变,发现差异基因与Rho A、EMT、TP53通路相关,因此,我们认为Cofilin-2可作为一个预测鼻咽癌放疗反应的蛋白标志物及潜在治疗靶点,并推测Cofilin-2可能通过激活Rho A、EMT、TP53通路,从而影响鼻咽癌CNE-2R细胞的放射抗拒性。