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目的:研究表明,慢性寒冷刺激诱导下,M2型巨噬细胞在皮下白色脂肪组织中大量积聚,并促进米色脂肪细胞的活化和产热。A1类清道夫受体(SR-A1)是一种巨噬细胞表面的模式识别受体,可以介导巨噬细胞中脂质的积累及巨噬细胞的极化分型等功能。研究表明,SR-A1在先天免疫、细胞凋亡和增殖中起关键作用。本课题组前期研究发现,SR-A1能够促进血管重构中和肥胖附睾脂肪组织中的巨噬细胞向M2型分化,因此具有拮抗炎症反应的作用。上述结果提示,SR-A1也可能在脂肪棕色化进程中发挥调控作用。为此,本课题拟针对SR-A1在脂肪棕色化进程中的作用及其机制开展深入研究。本研究对于发现新的肥胖相关性疾病干预靶点具有重要意义。方法:选取8周龄雄性SR-A1+/+(WT)小鼠和SR-A1-/-(KO)小鼠进行正常饮食下的30℃或6℃的刺激,刺激时间分别为1天、14天和30天。同时给予5-6周龄雄性WT小鼠和KO小鼠喂养正常饮食(CD)和高脂饮食(HFD)16周后,分别在30℃或6℃条件下刺激7天。在小鼠造模过程中,同步监测小鼠的体重变化,并在高脂饮食16周后进行小鼠代谢笼检测,检测小鼠基础代谢水平。造模结束后,收取小鼠皮下白色脂肪组织(ScWAT)和棕色脂肪组织(BAT),应用实时荧光定量PCR技术和免疫组织化学的实验方法,检测表征脂肪棕色化作用和程度的指标(UCP1、Cidea、Cox8b)。同时,收取造模小鼠血清,试剂盒方法检测甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)的表达量,ELISA试剂盒方法检测瘦素(leptin)和脂联素(adiponectin)的表达量。为了探究SR-A1在脂肪棕色化中的作用机制,我们进一步检测脂肪组织中巨噬细胞的表达以及M1型、M2型巨噬细胞的极化分型情况;我们提取小鼠皮下白色脂肪组织中基质血管成分(SVF),通过流式细胞术检测其中巨噬细胞的数量以及M1型、M2型巨噬细胞的比例。最后,体外提取3-4周龄WT小鼠皮下白色脂肪组织中前脂肪细胞,诱导分化为成熟脂肪细胞,同时用WT或KO小鼠腹腔巨噬细胞培养上清进行诱导分化,给予寒冷刺激1小时,随后检测成熟脂肪细胞的棕色化程度。结果:正常饮食的WT小鼠和KO小鼠,分别置于30℃或6℃刺激1天,检测发现WT和KO小鼠脂肪棕色化程度没有明显的差异。随后,我们延长刺激时间至14天和30天,结果显示,与WT 6℃小鼠相比较,KO 6℃小鼠皮下白色脂肪组织和棕色脂肪组织的棕色化程度(UCP1、Cidea、Cox8b等表达量)明显降低;寒冷刺激后,WT小鼠皮下白色脂肪组织和棕色脂肪组织中SR-A1表达量明显升高。同时,免疫组织化学结果显示,与WT 6℃小鼠相比较,KO 6℃小鼠皮下白色脂肪组织中UCP1蛋白表达量明显降低。说明SR-A1缺失后,给予寒冷刺激后,脂肪棕色化程度明显降低,SR-A1在寒冷刺激下小鼠脂肪棕色化进程中起到了促进和保护作用。接下来我们建立了小鼠高脂饮食16周并给予寒冷刺激7天的模型,体重监测结果显示,与WTHFD小鼠相比较,KO HFD小鼠体重明显增加。代谢笼检测证明,高脂饮食后,与WTHFD小鼠相比较,KO HFD小鼠的耗氧量、产热量明显降低,二氧化碳呼出量降低,呼吸频率并无明显差异,以上结果说明高脂饮食之后,KO小鼠的基础代谢水平明显降低,同时这与小鼠饮食摄入、饮水摄入以及累积移动路程之间并无直接关系。同时发现给予寒冷刺激后,小鼠体重明显降低,与WT HFD小鼠相比较,寒冷刺激下KO HFD小鼠体重下降比率明显减少。进一步检测脂肪组织的棕色化程度,结果发现,KO HFD寒冷刺激小鼠皮下白色脂肪组织和棕色脂肪组织的棕色化程度(UCP1、Cidea、Cox8b等表达量)相比于WT HFD小鼠明显降低。免疫组织化学结果显示,寒冷刺激下,KO HFD小鼠皮下白色脂肪组织中UCP1蛋白表达量亦明显降低。检测造模小鼠血清相关指标(TG、TCH、Leptin、Adiponectin)表达量,结果发现,寒冷刺激下,与WTHFD小鼠相比较,KO HFD小鼠血清中脂联素表达量降低,而甘油三酯、总胆固醇和瘦素的表达量没有明显差异。应用高脂饮食诱导的肥胖小鼠的寒冷刺激模型,进一步确认了 SR-A1在寒冷刺激下小鼠脂肪棕色化进程中起到了促进和保护作用。我们进一步探究寒冷刺激下脂肪组织中巨噬细胞数量的变化对于脂肪棕色化的作用。检测正常饮食小鼠寒冷刺激30天后小鼠脂肪组织中巨噬细胞,结果显示,与WT 6℃小鼠相比较,KO 6℃小鼠皮下白色脂肪组织中巨噬细胞(CD68、F4/80表达量)数量明显增加,其中M1型巨噬细胞(IL-6、TNF-α表达量)数量明显增加,而M2型巨噬细胞(Mgl表达量)数量明显降低。同时我们利用流式细胞术对正常饮食小鼠寒冷刺激30天后进行检测,结果显示,与WT 6℃小鼠相比较,KO 6℃小鼠皮下白色脂肪组织基质血管成分中M1型巨噬细胞比例有明显升高,而M2型巨噬细胞比例明显降低。由以上结果可知,当SR-A1存在的情况,寒冷刺激下小鼠脂肪组织中M2型巨噬细胞数量增加,促进小鼠脂肪棕色化的进程。最后,我们用小鼠腹腔巨噬细胞上清刺激小鼠皮下白色脂肪组织中前脂肪细胞诱导分化,给予寒冷刺激1小时后检测成熟脂肪细胞的棕色化程度。结果显示,巨噬细胞上清可以明显刺激脂肪细胞棕色化,与WT小鼠腹腔巨噬细胞上清刺激组相比较,KO小鼠腹腔巨噬细胞上清刺激分化的成熟脂肪细胞的棕色化程度明显降低。这一结果亦证明,SR-A1在寒冷刺激下小鼠脂肪棕色化进程中起到了促进和保护作用,并且这一进程是通过M2型巨噬细胞的极化反应得以实现。结论:寒冷刺激下,SR-A1促进小鼠皮下白色脂肪组织和棕色脂肪组织的棕色化作用,并且这一作用是通过M2型巨噬细胞的极化反应得以实现。