论文部分内容阅读
乳腺癌是一种女性常见恶性肿瘤,占全身恶性肿瘤的四分之一,且发病率逐年上升。根据生物学行为、分子及临床病理特征,可将乳腺癌分为多种类型。三阴性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)以及人表皮生长因子受体2(HER-2)均阴性表达的特殊类型乳腺癌。三阴性乳腺癌具有较高的肿瘤异质性,以侵袭性强,复发率高,远处转移迅速,预后差而著称。由于ER、PR的阴性表达,以及缺乏HER-2过表达,三阴性乳腺癌对曲妥珠单抗等相关靶向治疗未见明显好转反应,目前临床治疗只能选择化疗作为三阴性乳腺癌的主要治疗方式,但是三阴性乳腺癌对化疗药物存在耐药反应。研究证实,胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)被激活后可发挥有丝分裂原性,对细胞异型性以及肿瘤分化程度影响深远。因此,干扰IGF-1介导的相关信号传导通路可能是治疗三阴性乳腺癌的一种新选择。鬼臼苦素(picropodophyllin,PPP)是从美洲鬼臼和喜马拉雅鬼臼中分离得到的天然小分子药物,是一种IGF-1R酪氨酸激酶特异性抑制剂。相关研究表明,鬼臼苦素对结肠癌、卵巢癌、急性淋巴细胞白血病等多种肿瘤细胞增殖抑制作用明显。但由于鬼臼苦素对三阴性乳腺肿瘤细胞的影响研究尚无相关报道,为此,本研究探讨了IGF-1R抑制剂鬼臼苦素与三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的相关性,以期为鬼臼苦素成为乳腺恶性肿瘤的治疗药物提供实验依据。第一部分鬼臼苦素对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及细胞周期的影响目的:本研究的实验对象为人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231,探讨鬼臼苦素对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖以及细胞周期的影响,为将鬼臼苦素开发成为治疗三阴性乳腺癌药物提供实验依据。方法:1.MTT法检测不同浓度PPP(0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.6μmol/L、3.2μmol/L、6.4μmol/L)作用MDA-MB-231细胞株24h、48h、72h后,PPP对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响,并选择浓度分别为0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.6μmol/L的PPP药液应用于后续实验。2.倒置显微镜镜下观察不同浓度PPP作用MDA-MB-231细胞株48h后细胞形态结构以及数量的变化。3.流式细胞术检测不同浓度PPP作用MDA-MB-231细胞株48h后,对其细胞周期的影响。4.蛋白印迹法(Western blot)检测不同浓度PPP对MDA-MB-231细胞株处理48h后,细胞增殖核抗原(PCNA)以及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)蛋白相对表达水平的变化。5.使用SPSS19.0软件对相关实验数据进行统计学分析。结果:1.MTT法结果显示:PPP对MDA-MB-231细胞株的增殖活性存在明显抑制作用,并且呈现一定的时间-剂量依赖关系。2.倒置显微镜下观察发现:PPP处理MDA-MB-231细胞株48h后,与对照组相比,细胞失去原有上皮细胞样形态,回缩为折光性降低的圆形状态,并且细胞数量减少明显。3.流式细胞术结果显示:PPP处理MDA-MB-231细胞48h后S期细胞比例升高明显,G0/G1期细胞比例降低,G2/M期细胞比例未见明显变化;4.Western Blot结果显示:PPP作用MDA-MB-231细胞48h后,可以显著降低PCNA以及Cyclin D1的蛋白表达水平。结论:PPP能够有效抑制人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株的增殖并且诱导肿瘤细胞发生在S期阻滞,其机制与可能是与下调PCNA和Cyclin D1蛋白表达水平相关。第二部分鬼臼苦素抑制MDA-MB-231细胞增殖与IGF-1细胞信号通路相关性的研究目的:根据第一部分结果,进一步探讨鬼臼苦素抑制MDA-MB-231细胞增殖与IGF-1R调控的细胞信号通路的相关性方法:1.根据第一部分相关结果选定作用时间为48h,PPP浓度为0.8μmol/L,IGF-1浓度为100ng/ml。对照组、IGF-1组、PPP组、(IGF-1+PPP)组对细胞处理48h,应用MTT法检测细胞增殖活性。2.对照组、IGF-1组、PPP组、(IGF-1+PPP)组对细胞作用48h后,Western Blot检测IGF-1R、p IGF-1R蛋白表达水平。3.应用SPSS 19.0统计学软件对实验数据进行分析。结果:1.MTT法实验结果显示,与对照组相比,IGF-1组细胞增殖率上升明显;PPP组及(IGF-1+PPP)组细胞增殖率明显降低;并且PPP组与(IGF-1+PPP)组对细胞存活率无明显差异。2.Western Blot结果显示,相对于对照组,IGF-1组p IGF-1R的蛋白表达水平明显上调;PPP组及(IGF-1+PPP)组p IGF-1R的蛋白表达下调明显且PPP组与(IGF-1+PPP)组下调结果无明显差异;对照组、IGF-1组、PPP组、(IGF-1+PPP)组IGF-1R蛋白表达无明显差异。结论:PPP可拮抗IGF-1促进细胞增殖效果,并可以通过降低p IGF-1R的蛋白表达水平影响细胞增殖作用,提示PPP可通过抑制p IGF-1R高表达阻断IGF-1相关细胞信号通路。