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目的:建立一种经济实用、准确便捷的广地龙药材及其原动物的鉴定方法,解决广地龙药材因来源复杂等导致的难以准确鉴别的问题。同时,为今后药材质量控制及质量标准的制定等提供一个高效准确的鉴别方法,以保证药材的疗效及患者的用药安全。方法:1.赴上海、广州等地采集常见地龙物种,配置一系浓度的酒精,通过麻醉、固定及脱色制作成地龙标本,以利于后续样品基因组DNA的有效提取和长期保存。结合相关文献材料,在上海交通大学环节动物分类学专家邱江平研究员及其博士生蒋际宝的指导下,利用经典动物学分类法对所采集的地龙样本进行物种鉴定。2.结合GenBank数据库中有关蚯蚓的COI、16SrRNA和12SrRNA基因序列设计通用引物,优化PCR条件,对包括广地龙原动物参环毛蚓Pheretimaas pergilum(E Perrier)在内的10种蚯蚓的COI、16SrRNA以及12SrRNA基因序列进行PCR扩增,扩增产物纯化后送华大基因生物公司测序,测序结果利用DNAStar校对,采用CondonCode Aligner 进行序列拼接,并将结果进行 BLAST(Basic Local Alignment Search)相似性搜索,以验证COI、16SrRNA和12SrRNA基因片段的扩增和测序结果的准确和可靠。3.利用DNAMan软件对所得COI、16SrRNA和12SrRNA基因序列进行多重序列比对,分析正、混品间DNA序列差异,选择差异位点较多的基因序列设计出能特异性扩增广地龙原动物参环毛蚓Pheretimaas pergilum(EPerrier)的特异性鉴别引物数对,从中筛选出一对具有高特异性的鉴别引物,依此建立参环毛蚓Pheretimaas pergilum(E Perrier)高特异性PCR鉴别方法,并对该方法的稳定性及个体差异的影响进行研究。4.将所建立的方法应用于市售广地龙药材及混合粉末的鉴别中,检测该特异性鉴别引物的通用性和适用性。结果:1.经鉴定,本研究共采集到链胃蚓科杜拉蚓属、巨蚓科远盲蚓属等3科4属共10种地龙样品。2.经测序得到各样品大小约为700bp、350bp、320bp的COI、16SrRNA和12SrRNA基因序列,经BLAST(Basic Local Alignment Search)相似性搜索,结果表明COI、16SrRNA和12SrRNA基因片段的扩增和测序结果是准确和可靠的。3.利用DNAMan软件对所得C0I、16SrRNA和12SrRNA基因序列进行多重序列比对,分析正、混品间DNA序列差异,COI基因差异位点所占百分比为17.08%,16SrRNA和12SrRNA基因序列差异位点所占百分比分别为15.84%、45.43%,选择差异位点较多的12SrRNA基因序列设计3对能特异性扩增参环毛蚓的鉴别引物,通过实验筛选出参环毛蚓Pheretimaas pergilum(EPerrier)高特异性鉴别引物12st/12stf,依据该鉴别引物所建立的参环毛蚓Pheretimaas pergilum(E Perrier)高特异性PCR鉴别方法具有良好的稳定性且不会受到个体差异的影响。4.将所建立的方法应用于市售广地龙药材及混合粉末的鉴别中,结果准确且具有较高的稳定性。结论:本研究所建立的广地龙高特异性PCR鉴别方法成功实现了对广地龙原动物、市售广地龙药材及混合粉末的准确鉴定,该方法突破了传统经典鉴别方法的局限性,操作简单、方便快捷,不受个体差异(不同产地和不同居群)及实验环境的影响,表现出较高的可靠性和稳定性,具有较高的推广应用价值。