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目的:1.体内实验:探讨消癖颗粒(XIAOPI)对MMTV-PyMT转基因小鼠自发乳腺癌的抑制作用及相关通路mRNA表达的影响,了解消癖颗粒体内预防乳腺癌变发生的作用。2.体外实验:采用雌二醇(17β-estradiol,E2)诱导正常乳腺上皮细胞MCF-10A与MCF-12A细胞,模拟乳腺癌发生的细胞学变化过程,观察消癖颗粒干预E2诱导乳腺细胞氧化指标和生物学表型等的变化,并探讨消癖颗粒对预防乳腺细胞癌变作用的分子机制。方法:1.消癖颗粒对MMTV-PyMT小鼠的治疗作用及对E2/ROS/Nrf2信号通路的调控作用MMTV-PyMT雌性小鼠12只,适应性喂养3周后,将小鼠随机分为空白组、XIAOPI组。每天灌胃给予相应的药物或生理盐水,持续给药12周,分别在第9周、15周取材检测。1.1检测小鼠血液生化指标:雌激素、活性氧、8-OHdG、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶的水平,乳腺组织和肺组织病理形态学检测评价XIAOPI的药效;免疫组化检测Nrf2、HO-1、NQO1和Laminin在乳腺组织中的表达,评价XIAOPI在预防乳腺癌的治疗作用。1.2使用PCR技术检测乳腺组织中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的表达水平。2.消癖颗粒在E2诱导正常乳腺上皮细胞中的保护作用及对E2/ROS/Nrf2信号通路的调控作用2.1采用MTT实验、划痕实验、克隆实验、流式细胞术探讨XIAOPI是否影响E2对正常乳腺上皮细胞的增殖、迁移、克隆能力和凋亡水平。2.2采用DCFH-DA荧光探针法检测活性氧(ROS)水平,运用微量酶标法测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,可见光法检测CAT活性,羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,ELISA法测定8-OHdG水平,探讨XIAOPI是否影响E2对正常乳腺上皮细胞的细胞毒性、ROS水平、氧化酶活性和DNA氧化损伤程度。2.3采用Western-blot实验和Real-Time-PCR实验检测相关通路蛋白和mRNA水平,验证XIAOPI在乳腺癌预防中的作用靶点。结果:1.消癖颗粒对MMTV-PyMT小鼠的治疗作用及对E2/ROS/Nrf2信号通路的调控作用1.1与空白组相比较,XIAOPI可以抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺自发产生的肿瘤数目及瘤体的生长(瘤体重量和体积);组织HE染色结果提示,XIAOPI可以抑制乳腺肿瘤的发生发展和肺转移;免疫组化结果显示,XIAOPI组Laminin表达水平明显低于空白组,同时XIAOPI可以促进Nrf2及NQ01、HO-1的表达。血清生化指标进一步表明:XIAOPI干预15周后,小鼠体内ROS、E2和与8-OHdG的水平均明显降低、氧化酶(CAT、SOD、GSH-PX、T-AOC)水平明显升高。1.2 PCR结果显示,与空白组相比较,Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的表达水平明显增高,表明XIAOPI可以激活E2/ROS/Nrf2信号通路,调节机体的氧化应激。2.消癖颗粒在E2诱导正常乳腺上皮细胞中的保护作用及对E2/ROS/Nrf2信号通路的调控作用2.1 MTT法检测细胞活力实验结果:(1)E2在0.5-10 nM浓度范围内对MCF-10A与MCF-12A细胞生长有促进作用,并呈剂量在5 nM具有最佳促进作用。(2)XIAOPI可抑制E2对MCF-10A与MCF-12A细胞生长的促进作用。2.2 DCFH-DA荧光探针检测结果表明,E2可以诱导MCF-10A与MCF-12A细胞内ROS的生成增多,加入XIAOPI共处理后,可以降低ROS水平;LDH、CAT、SOD检测结果表明,E2会诱导细胞LDH漏出量的上升,增加细胞的损伤程度,同时氧化酶(SOD、CAT)的活性明显被抑制,加入XIAOPI共处理后,细胞LDH漏出量明显下降,并且氧化酶(SOD、CAT)的活性明显增加;ELISA检测结果表明,E2可诱导细胞内8-OHdG水平明显上升,导致细胞的DNA损伤,XIAOPI治疗后,细胞内DNA损伤程度明显降低,8-OHdG的水平明显下调;表明XIAOPI可以调节E2诱导的氧化应激,降低机体的氧化损伤。2.3细胞凋亡检测结果:与空白组相比较,E2刺激下,MCF-10A与MCF-12A细胞增殖表现为凋亡水平的明显下降;与E2组相比较,加入XIAOPI共处理后,可逆转E2诱导作用,增加细胞凋亡率,恢复正常凋亡水平。2.4细胞迁移实验和平板克隆实验检测细胞迁移及克隆能力结果:与空白组相比较,E2可明显增强MCF-10A与MCF-12A细胞的迁移能力和克隆能力;与E2组比较,加入XIAOPI共处理后,E2增强的迁移能力和克隆能力被明显抑制。2.5 Western-blot 和 Real-Time-PCR 检测结果:E2 可抑制 MCF-10A 和 MCF-12A细胞中Nrf2和HO-1蛋白的表达,与空白组相比较,差异有统计学意义(P<0.05);XIAOPI共处理后,E2的抑制作用被阻断,Nrf2和HO-1蛋白表达水平升高,与E2组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。在E2的刺激下,MCF-10A和MCF-12A细胞中Nrf2、HO-1和NQO1 mRNA的表达水平明显降低,与空白组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。加入XIAOPI共处理后,可以激活被E2抑制的Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的表达,与E2组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.消癖颗粒对预防MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤的发生具有良好的治疗效果,其具有抑制乳腺癌的发生、生长和肺转移的作用,并体现对机体内环境的调节上,通过降低机体E2水平,增强氧化酶(CAT、SOD、GSH-PX、T-AOC)的活性,消除ROS的积累,降低8-OHdG水平预防DNA损伤;其机制可能是消癖颗粒通过激活E2/ROS/Nrf2通路,抑制氧化应激,从而防止DNA的氧化损伤,达到预防乳腺癌变的目的。2.在细胞水平,消癖颗粒可以改善雌激素诱导氧化应激及预防DNA损伤;抑制雌激素对正常乳腺上皮细胞的增殖、迁移及克隆能力的促进作用;逆转雌激素刺激下乳腺上皮细胞的异常生长,并促进细胞正常凋亡,通过激活被雌激素抑制的Nrf2信号通路,抑制细胞的异常增殖。其机制可能是消癖颗粒通过激活E2/ROS/Nrf2通路,抑制氧化应激,从而防止DNA的氧化损伤,达到预防乳腺细胞癌变的目的。综合体内外实验研究,发现消癖颗粒对雌激素具有良好的调控作用,在降低机体氧化应激,消除活性氧等有害物,预防DNA氧化损伤,预防乳腺组织癌变具有良好疗效;并阐释了其发挥预防作用的分子机制与E2/ROS/Nrf2信号通路的调控相关,为临床上探索预防乳腺癌的有效且安全方法提供实验依据。