研究背景:慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)是全球主要的公共卫生问题之一,具有显著的发病率、死亡率和医疗成本。CKD患者的肾脏结构和功能不可逆损伤,最终可发展为终末期肾脏病(End-stage renal disease,ESRD),常需要昂贵的肾脏替代治疗,如:血液透析、腹膜透析或肾移植治疗。此外,ESRD患者常可出现急性左心衰、严重高钾血症、消化道出血、中枢神经系统功能障碍等危及生命的并发症,死亡率高,预后差。据估计,每100名接受透析治疗的患者中,每年约有10-20名死亡。然而,目前尚没有明确的治疗方法可以有效阻止CKD的进展。虽然肾脏替代治疗能够某种程度上延长CKD患者的生存时间,但患者的生活质量严重受影响,而且给患者的家庭以及国家造成了重大的经济负担。因此,寻找新的生物诊断标志物,以便更早发现肾功能下降,以及探索新的治疗靶点是当前CKD诊治研究领域的挑战,也是迫切需要的。肠道微生态系统是人体的重要组成部分,正常的肠道微生物组是维持人体健康所必需的。肠道微生物组与宿主的营养、代谢和免疫等诸多重要生理功能紧密相关,其种类及数量的变化可导致疾病的发生和进展。Science、Nature等杂志相继发表文章,认为肠道微生物组相当于人体一个重要的代谢“器官”。肠道菌群“肠型”构成可以反映人的疾病易感性,提示肠道微生物标志物具有潜在的预警和诊断作用。目前,已有文献报道了肠道微生物标志物可作为早期肝细胞癌、自身免疫性肝炎、肿瘤以及2型糖尿病的无创诊断工具,且肠道微生物与高血压、肥胖症等慢性代谢性疾病的发生发展密切相关。近年来,随着“肠-肾轴”理论的提出,肠道微生物组在CKD中的作用越来越受到重视。研究发现,接受透析的ESRD患者的粪便中,包括肠杆菌科、莫拉菌科、盐单胞菌科在内的190个操作分类单元(Operational taxonomic units,OTUs),明显不同于健康人。ESRD患者存在肠黏膜屏障结构和功能的损害,肠道微生物可能通过菌群移位、炎性反应和免疫反应等影响ESRD患者的全身炎性反应。一些代谢产物,如:氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide,TMAO)、硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate,IS)和对甲酚硫酸盐(P-cresyl sulfate,PCS)对肾脏的毒性损害作用也可能与肠道微生物相关。一项针对CKD早期患者的研究表明,血清PCS和IS水平可作为肾功能下降的早期指标,且在CKD早期患者中可以检测到与PCS和IS相关的肠道微生物的变化。然而,目前的研究主要集中在ESRD患者的肠道微生物变化特征和肠道代谢物水平的变化特征,尚未充分探讨非透析CKD患者肠道微生物的具体变化特征以及肠道微生物标志物在CKD诊断中的应用价值。为明确人体肠道微生物组在非透析CKD中的变化特征并探索肠道微生物标志物在CKD诊断中的应用价值遂进行以下研究。研究目的通过临床大样本的Miseq测序探索人体肠道微生物组在非透析慢性肾脏病(CKD)中的改变特征及在不同临床分期CKD中的特征,并探讨肠道微生物标志物作为CKD无创诊断工具的应用价值。方法收集我国不同地区的非透析CKD患者及健康志愿者的粪便样本共520份。经过严格的排除标准,对其中的503份样本进行了 DNA提取和16SrRNA测序。经过严格的数据质量控制,最终纳入489份粪便样本的测序数据进行分析,其中包括郑州地区的CKD样本159份,杭州地区的CKD样本57份,郑州地区的健康对照样本273份。郑州地区的粪便样本被随机地分为发现阶段(CKD组110份、健康对照组210份)和验证阶段(CKD组49份、健康对照组63份)。在发现阶段,我们对CKD组和健康对照组肠道微生物组的系统发育情况进行描述和比较,鉴定了其关键的微生物标记物,并构建了 CKD分类器模型。在验证阶段,我们通过49份CKD样本和63份健康对照样本验证了该CKD分类器的诊断效能。最后,我们通过57份杭州地区的CKD样本对该CKD分类器的诊断效能进行独立诊断验证。此外,根据CKD临床分期,我们把发现阶段的110份CKD样本分为A、B、C三组(A组:CKD 1-2期患者样本26份;B组:CKD 3-4期患者样本36份;C组:CKD 5期患者样本48份),并对三组CKD样本微生物组的系统发育情况进行描述和比较。结果1.CKD组的肠道微生物多样性与健康对照组相比显著降低,P<0.05,差异有统计学意义,而CKD 1-2期、CKD 3-4期和CKD 5期的肠道微生物多样性无显著差异,P>0.05,差异无统计学意义。2.包括大肠志贺氏杆菌属、克雷伯氏菌属、嗜血杆菌属在内的24个细菌属在CKD组中占优势,而包括粪杆菌属、罗斯氏菌属、布劳特氏菌属在内的9个细菌属在健康对照组中占优势。3.基于肠道微生物组基因预测功能的分析,包括抗坏血酸盐代谢、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢在内的50项微生物功能在CKD组中占优势;而包括精氨酸和脯氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、赖氨酸生物合成在内的36项微生物功能在健康对照组中占优势。4.不同临床分期CKD肠道微生物相比,软壁菌门和柔膜细菌目在CKD1-2期占优势,副萨特氏菌属在CKD3-4期占优势,艾克曼菌属、劳特氏菌属和疣微菌门在CKD 5期占优势。5.利用随机森林模型的5倍交叉验证确定了 5个最优微生物标记物,且基于这些微生物标志物所构建的CKD分类器在发现阶段达到了 0.9887的曲线下面积(AUC),在验证阶段达到了 0.9512的AUC,在独立诊断阶段达到了0.8986的AUC。结论1.非透析CKD人体肠道微生物组的多样性降低,临床分期对非透析CKD肠道微生物组的多样性影响不大。2.非透析CKD人体肠道微生物组的群落组成、分布、功能等方面与健康人群相比均存在显著变化,改变的肠道微生物可通过影响机体物质代谢及代谢途径促进CKD进展。3.肠道微生物靶向生物标志物对CKD具有强大的诊断潜力,有望成为CKD的无创诊断工具。