桃叶片愈伤组织诱导及遗传转化体系构建

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桃是落叶小乔木,果实味道可口,花极具观赏性,茎和根可入药。桃有吉祥长寿的寓意更受到我国人民的喜爱。木本植物的传统育种至少需要8-10年的时间,过长的时间导致育种者的工作量大大增加。生物工程技术的高速发展,为园艺产品改良、新种质资源的培育和扩繁提供契机。然后,桃树的再生体系和遗传转化体系尚不成熟,急需开展深入研究。基于此,本试验外植体来自毛桃、‘秋蜜红’和‘中油桃14号’的叶片,通过不同植物生长调节剂浓度组合对不同品种或类型桃叶片愈伤组织诱导过程中愈伤组织形成率和相对生长量的比较探究,以期能获得适宜桃愈伤组织的诱导培养基;此外,以毛桃和‘中油桃14号’叶片为外植体进行根癌农杆菌介导的遗传转化试验,研究影响转化效率的不同菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度和侵染方式等因素,初步建立为后续桃基因功能验证奠定基础的叶片遗传转化体系。主要研究结果如下:1.不同基因型桃组培苗的获得研究表明毛桃、‘秋蜜红’和‘中油桃14号’的田间带顶芽或腋芽茎段,在不同升汞(0.1%)处理时间后,统计各品种顶芽和腋芽的萌芽率分别为85.01%和72.88%(毛桃),80.02%和69.02%(‘秋蜜红’);84.41%和78.81%(‘中油桃14号’)。毛桃和‘中油桃14号’组培苗适宜的初代培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+AgNO3 0.5 mg·L-1,‘秋蜜红’组培苗适宜的初代培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+AgNO3 0.5 mg·L-1。2.不同基因型桃叶片愈伤组织的诱导(1)毛桃叶片愈伤组织诱导适合毛桃组培苗叶片愈伤组织诱导的培养基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 1.2 mg·L-1+AgNO3 0.5 mg·L-1,其愈伤组织形成率和愈伤组织相对生长量分别为88.09%和3;毛桃胚培苗叶片愈伤组织再生的最适培养基为MS+AgNO3 0.5 mg·L-1+TDZ 1.0 mg·L-1+NAA 1.5mg·L-1,其愈伤组织形成率和愈伤组织相对生长量分别为69.77%和4。两种来源毛桃叶片产生的愈伤组织在最适培养基中均能诱导出黄绿色的愈伤组织,紧实有突起,这意味着该愈伤组织具备良好的再生能力。(2)‘秋蜜红’和‘中油桃14号’组培苗叶片愈伤组织诱导‘秋蜜红’组培苗叶片最适诱导愈伤组织再生的培养基是MS+AgNO3 0.5 mg·L-1+TDZ1.0 mg·L-1+2,4-D 1.2 mg·L-1,其愈伤组织形成率和愈伤组织相对生长量分别为64.55%和4;‘中油桃14号’组培苗叶片最适诱导愈伤组织再生的培养基是MS+AgNO3 0.5 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 1.2 mg·L-1,其愈伤组织形成率和愈伤组织相对生长量分别为61.15%和2。三种基因型桃叶片均能诱导出生长状态良好,黄绿色,紧实有突起,具备良好的再生能力的愈伤组织。但是不同基因型和相同基因型不同来源的叶片最适宜的愈伤组织诱导培养基添加的生长调节剂种类和农低不同。毛桃和‘中油桃14号’组培苗初代培养和叶片愈伤组织用的培养基一样,这两种基因型桃可以进行进一步的关联研究。3.构建毛桃和‘中油桃14号’叶片遗传转化体系(1)毛桃叶片遗传转化体系构建毛桃组培苗叶片最佳的转化体系是菌液浓度OD600=0.5,采用常规侵染外植体15 min后转入加有乙酰丁香酮20 mg·L-1的共培养培养基中,共培养4 d,最高的GUS瞬时表达率为65.29%;毛桃胚培苗叶片是菌液浓度OD600=0.5,采用抽真空辅助侵染外植体10 min后转入加有乙酰丁香酮30 mg·L-1的共培养培养基中,共培养2 d,最高的GUS瞬时表达率为76.45%。两种来源毛桃叶片的遗传转化情况差异明显,且组培苗叶片的转化效果优于胚培苗叶片转化效果。(2)‘中油桃14号’组培苗叶片遗传转化体系‘中油桃14号’组培苗叶片最佳的转化体系为菌液浓度OD600=0.5,采用超声波辅助侵染外植体10 min后转入加有乙酰丁香酮40 mg·L-1的共培养培养基中共培养3 d,最高的GUS瞬时表达率为72.01%。在遗传转化过程中,不同基因型和相同基因型不同来源的叶片的GUS瞬时表达率均在65%以上且最适菌液浓度是一样的,但是他们在其他方面的条件还存在一定的差异,表明不同基因型桃叶片遗传转化的具体方法随基因型和来源不同而变化。
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