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剑麻是世界上最重要的热带纤维作物,具有广泛应用价值和发展前景。然而由于目前我国剑麻主栽品种单一,极易遭受各种病害侵袭,导致剑麻减产,造成严重的经济损失,因此培育剑麻抗病品种十分迫切。由于剑麻是多年生植物,一般生长10年以上才开花,因此常规育种周期长、效率低,以致于60多年也未育出比主栽品种H.11648更优良的品种。细胞生物学的快速发展为剑麻细胞工程育种提供了新的技术途径,通过对剑麻的细胞、细胞团或原生质体的各项操作,建立悬浮细胞培养体系,再通过诱导筛选或转基因,可以得到能够稳定遗传的突变或转基因植株,从而筛选到抗病的剑麻株系,创制新的抗病种质,最终培育抗病品种,可大大缩短育种周期,提高育种效率。本研究利用H.11648杂交剑麻无菌幼苗建立剑麻胚性悬浮细胞培养与再生体系,进而把剑麻的悬浮细胞或细胞团作为遗传转化的受体,采用“冻融法”将表达载体(pCAMBIA3301-pUC57-Hevein)导入到了农杆菌EHA 105中,研究影响农杆菌侵染剑麻悬浮细胞的各种因素,通过对遗传转化条件进行筛选,为剑麻的抗病品种培育提供了新途径。主要研究结果如下:1.优化剑麻H.11648外植体诱导愈伤组织的影响因素。利用剑麻无菌幼苗的茎、叶、茎尖(生长点)作为外植体,确定MS为基本培养基,通过试验,发现幼叶是最适宜的外植体材料。将剑麻幼叶接种到MS+2.0mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培养基上诱导,经过1～2次的继代培养过后,得到大量均一的胚性愈伤组织。2.建立剑麻H.11648悬浮细胞体系。接种剑麻胚性愈伤到培养基中(MS+2,4-D 1.5 mg/L+6-BA 4.0 mg/L+350 mg/L 水解酪蛋白,30 g/L 蔗糖,pH 5.8)进行细胞培养。发现剑麻细胞生长符合“S”型,最佳的继代时间为7 d。剑麻悬浮细胞在早期生长阶段,pH值出现下降,在对数生长期,pH值慢慢升高,后期趋于平缓。3.筛选悬浮细胞再生方式。发现液体悬浮培养是最适合剑麻悬浮细胞的再生方式。以这种培养方式再生的植板率为0.193%,再生周期约为28 d,分化数量相对较多。平板上的细胞经过低温2h的处理,可以明显的提升悬浮细胞的再生率。最终确定再生愈伤的最佳分化配方为MS+NAA0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L,采用生根培养基(1/2 MS+0.1 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+6 g/L卡拉胶)对再生的幼苗进行生根,经过21 d左右培养,取出幼苗,洗净根部后移栽到椰糠和沙子1:1的基质中进行炼苗。4.优化剑麻H.11648胚性悬浮细胞转化因素。优化剑麻胚性悬浮细胞转化因素。结果表明用于侵染的农杆菌最佳菌液浓度为OD 600=0.5～0.6,浸染时间30 min,共培养3d,乙酰丁香酮(AS)浓度为200 μmol/L。5.筛选抗性愈伤组织以及获得转基因植物。通过对抑菌能力测试和对愈伤生长的影响,综合考虑,本实验决定采用300 mg/L Car进行筛选。开始使用含5 mg/L PPT的培养基培养一周,再转移到含有10 mg/L PPT的培养基上培养一周,最后PPT提高到15mg/L。然后通过PCR与RT-PCR进行验证转化幼苗。