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杆状病毒(Baculovirus)是一种双链环状DNA病毒,具有良好的生物安全性、在哺乳动物细胞中不复制、插入和展示容量高、能转导多种哺乳动物细胞,可激活较强的天然免疫、哺乳动物体内不存在针对杆状病毒载体的免疫以及易于操作等优点,但是由于杆状病毒自身对哺乳动物血清补体的高度敏感以及在哺乳动物免疫细胞上极低的转导效率和转基因表达,使得杆状病毒载体疫苗的免疫效果受到极大影响。为克服杆状病毒被补体清除,目前已通过多种遗传和化学修饰方法对杆状病毒进行了表面改造,如替换GP64囊膜蛋白为VSVG,对杆状病毒表面进行PEG修饰,表面展示补体抑制蛋白DAF或MCP等策略降低补体对杆状的清除。课题小组前期研究发现:(1)表面展示猪IgG1 Fc能使杆状病毒逃逸补体的清除;(2)猪II型圆环病毒(PCV2)Cap蛋白可与补体经典通路分子C1QBP互作,推测Cap可能参与补体调控;(3)人三型腺病毒penton蛋白能自组装形成病毒样颗粒,并可作为抗原递送工具,在体内诱导很强的体液免疫和细胞免疫,所以推测penton蛋白可能也参与了补体调控以保持其在体内的稳定和诱导高水平获得性免疫。基于以上研究基础,本论文拟比较展示IgG1 Fc、Cap和Penton,重组杆状病毒逃逸补体清除能力,筛选可辅助杆状病毒逃逸补体清除的潜在补体抑制元件,为进一步构建高效疫苗递送载体疫苗提供理论依据,主要结果如下:1.构建杆状病毒表面展示载体将猪IgG1 Fc、猪圆环病毒Cap蛋白和人腺病毒penton蛋白插入到实验室构建的载体p FBDM-P10-gp64SP-vsvg ED的gp64SP(N端带有His标签)和vsvg TM之间,再引入哺乳动物细胞表达盒CAGG-e GFP作为报告系统,用于后续体外评估重组病毒的转导效率。最终构建如下四株重组杆状病毒载体pFBDM-P10-gp64SP-vsvgED-CAGG-eGFP,pFBDM-P10-gp64SP-Fc-vsvg ED-CAGG-e GFP,pFBDM-P10-gp64SP-Cap-vsvg ED-CAGG-e GFP,pFBDM-P10-gp64SP-penton-vsvgED-CAGG-eGFP。2.重组杆状病毒的包装将上述构建的重组穿梭载体转染Sf9细胞,得到BV-vsvg-ED、BV-vsvg-ED-pFc、BV-vsvg-ED-Cap和BV-vsvg-ED-penton四株重组杆状病毒,经PCR、Western blot、IFA和激光共聚焦显微镜鉴定结果证明重组病毒构建成功。3.重组杆状病毒逃逸猪血清补体清除活性检测采用体外拮抗补体能力试验显示,四株重组病毒逃逸补体能力依次为BV-vsvg-ED-Cap(68.3%)>BV-vsvg-ED-pFc(65.5%)>BV-vsvg-ED-penton(37.6%)>BV-vsvg-ED(20.1%)。4.重组杆状病毒逃逸猪血清补体清除机理初步研究通过protein G树脂除去血清中的IgM和IgG,与正常血清处理组(66.3%)相比,病毒存活率得到显著提高(80.2%),证明了IgM或IgG介导的经典通路在补体系统对杆状病毒的灭活中起到了一定的作用。在旁侧通路中,将BV-vsvg-ED-pFc在类哺乳动物糖基化加工的mimic Sf9和昆虫细胞糖基化加工的Sf9细胞中分别增殖,发现重组病毒在两种不同糖基化类型细胞中的增殖后的存活率无显著差异,推测旁侧通路在BV-vsvg-ED-pFc逃逸补体方面作用可能不明显。同时发现表面展示PCV2 cap基因的重组杆状病毒BV-vsvg-ED-Cap组与BV-vsvg-ED+cap组(即BV-vsvg-ED与cap蛋白混合)在血清中的存活率几乎相同。本研究通过杆状病毒表面展示补体相关元件(IgG1Fc、Cap和Penton)筛选可辅助杆状病毒逃逸补体的有效元件,结果证明了展示猪IgG1Fc和猪圆环病毒Cap蛋白能辅助杆状病毒有效逃逸补体的清除。以上结果对杆状病毒载体系统在猪载体疫苗领域的进一步应用奠定了基础。