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花生是重要的油料作物之一,我国是花生生产、消费及出口大国。由于蛴螬独特的生活习性,常规的化学与生物防治手段难以有效防治,对花生的为害逐年加重,严重影响了花生的产量和品质,急需开辟新的防治途径。苏云金芽胞杆菌cry8类基因编码的晶体蛋白对金龟科、叶甲科等多种鞘翅目害虫有特异的杀虫活性。cry8Ea1、cry8Ha1基因是本实验室克隆的、具有自主知识产权的新基因,对金龟科暗黑腮金龟具有很高的特异毒杀作用。因此建立高效的花生遗传转化体系、构建转基因抗虫花生具有重要的理论意义和实用价值。本研究首先建立了发根农杆菌介导的花生遗传转化体系,优化了影响转化效率的各因素,获得含有转cry8类基因根系的嵌合植株,并且快速鉴定转基因根系抗地下害虫能力,利用根癌农杆菌介导的花生遗传转化,获得了转cry8类基因花生植株,主要研究结果如下:花生高效表达载体的构建。克隆了烟草的核基质附着序列(MAR),插入pCAMBIA2300载体,得到含有顺式重复MAR序列的基础载体pDMAR。从烟草中克隆了根特异性启动子TobRB7,分别将TobRB7启动子和35S启动子插入基础载体pDMAR。同时在合成的cry8Ea1、cry8Ha1基因的上游添加了Ω序列和Kozak序列,下游添加了内质网定位信号(KDEL),引入优化的载体中,分别得到由根特异性启动子TobRB7及组成型启动子35S驱动的cry8类基因的表达载体,并导入发根农杆菌和根癌农杆菌中。发根农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立。利用发根农杆菌将含有报告基因gfp及GUS基因的载体pGFPGUSplus导入花生根系中,Southern杂交表明gfp基因整合到花生根系基因组中,RT-PCR及GUS染色的结果显示,gfp基因在转基因根系中能正常转录,GUS基因能表达为有活性的酶,证明通过该体系可以成功的将外源基因导入到花生根系中。探索了花生基因型、发根农杆菌活力及接种量等因素对转化效率的影响,确定最佳的转化条件为接种指数期的发根农杆菌,接种量为每个外植体5×10~7个细胞,共培养2天,共培养培养基中乙酰丁香酮的浓度为50μmol l-1,最大转化效率为61%。利用该体系转化花生,从花生播种到获取足量可用于分子鉴定及生测的转化根,需要45天,是一个快速高效的转化体系。转cry8Ea1和cry8Ha1基因花生根系的获得。将由组成型启动子35S驱动cry8Ea1、cry8Ha1基因导入花生白沙1016中,分别有21株和33株嵌合植株RT-PCR鉴定为阳性。移栽成活的植株接种暗黑鳃金龟幼虫,分别有62.5%和66.7%的含转基因根系的嵌合植株危害等级为0级,植株地上部分生长旺盛,地下根系比较发达。生物活性测定的结果表明,经密码子优化的cry8Ea1、cry8Ha1基因在花生中异源表达后对暗黑鳃金龟有较好的杀虫活性。根癌农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立。以幼叶和去胚子叶为外植体,添加NAA、TDZ和6-BA外源激素,最大的芽诱导率分别可以达到40.9%和48.3%。通过根癌农杆菌浸泡叶片和去胚子叶外植体,得到卡那抗性植株。经PCR鉴定,分别有30株和5株cry8Ea1、cry8Ha1基因为阳性。ELISA的结果表明,Cry8Ha1蛋白占叶片可溶性蛋白可达0.24%。本研究建立了快速鉴cry8类基因在花生根系中抗蛴螬能力的体系,并利用根癌农杆菌介导的花生遗传转化得到了转cry8Ea1、cry8Ha1基因的花生植株,为培育抗地下害虫蛴螬的花生新品种奠定基础。