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背景:副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种广泛分布于海产品和咸水环境中的革兰氏阴性菌,可导致胃肠道炎症,还能引发危及生命的败血症。国内外发布的法规和标准都明确规定,在众多食品的检测中都要求不得检出,目前的主要检测方法是《GB 4789.7-2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》,检验程序包括前增菌-选择性增菌-选择性平板分离-生物化学筛选-血清学鉴定等步骤,通常需要5~7天才能完成检测,操作繁琐。除传统的培养鉴定方法外,《SN/T 2424-2010进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光PCR法》采用实时荧光PCR方法,通过增菌-核酸提取-荧光PCR检测步骤,操作相对简便、检测周期相对较短,但需要昂贵的设备和专业技术人员,较难满足市场需求。环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,简称LAMP)是一种新式核酸等温扩增技术,由日本的Notomi等研发,具有简单、快速、特异性强的特点,其原理是针对靶基因的特定区域设计特异性引物,在具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下,能在等温条件下实现靶基因的一步扩增,引入环引物后,扩增效率还可大大增加。目的:1.针对副溶血性弧菌的特异性基因—tlh基因设计不同引物并对引物进行筛选,对反应体系进行优化,建立针对副溶血性弧菌的特异性强、灵敏度高、重现性好的LAMP方法。2.以优化后的LAMP方法为基础,建立针对海产品中副溶血性弧菌的方便快速、特异性强、灵敏度高的LAMP检测系统。方法:1.针对副溶血性弧菌的不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)tlh基因,设计2套引物并筛选出出峰时间早、检测信号强、无非特异性扩增的引物序列,在反应体系中加入SYTO-9荧光染料,60~65℃的恒温条件下保温30~60min,即可完成靶序列的特异性扩增,通过仪器可实时监测反应结果。对建立的LAMP方法从Mg2+浓度、甜菜碱浓度、d NTPs浓度和反应温度4个变量参数进行优化,并对方法的特异性、灵敏度、重现性进行评价。2.建立完整的LAMP检测系统——包括优化后的LAMP方法和根据本方法研制的副溶血性弧菌核酸检测试剂盒以及Deaou-308℃恒温荧光检测仪,利用该检测系统对1株副溶血性弧菌标准菌株、50株副溶血性弧菌野生菌株、8株副溶血性弧菌近源菌株以及40份加标海产品样品(包括加工海鲜食品、鱼类、贝类等样品)进行检测,评价LAMP检测系统的特异性和灵敏度。结果:1.建立并优化的LAMP检测方法反应体系为:内引物(FIP、BIP)各1.6μmol/L,外引物(F3、B3)各0.2μmol/L,环引物(LF、LB)各0.8μmol/L,6mmol/LMg2+,8UBst大片断DNA聚合酶,1.6 mmol/Ld NTP,0.2μmol/LSYTO-9,DNA模板200ng,反应温度:63℃,反应时间:45min。2.特异性实验结果显示,本方法对副溶血性弧菌检测结果均为阳性;对6株副溶血性弧菌近源菌株、14株常见的其他致病菌株检测结果均为阴性,方法特异性良好。3.灵敏度实验结果显示,本方法对副溶血性弧菌纯培养物的灵敏度为103CFU/m L,副溶血性弧菌质粒DNA灵敏度可达1fg/μl。4.重现性实验结果显示,本方法对副溶血性弧菌质粒DNA检出限以上浓度重复20次检测结果均为阳性,对阴性样品重复20次检测结果均为阴性,重现性良好。5.LAMP检测系统(包括优化后的LAMP方法和根据本方法研制的副溶血性弧菌核酸检测试剂盒以及Deaou-308℃恒温荧光检测仪)的特异性实验结果显示,对1株副溶血性弧菌标准菌株和50株副溶血性弧菌野生菌株检测结果均为阳性,对8株副溶血性弧菌近源菌株检测结果均为阴性,特异性良好。6.LAMP检测系统的灵敏度实验结果显示,对40份加标海产品样品(包括加工海鲜食品、鱼类、贝类等样品)的检测灵敏度均可达到103CFU/m L。结论:1.针对副溶血性弧菌的tlh基因建立并优化的LAMP快速检测方法具有方便快速、特异性强、灵敏度高、重现性好的优点,为副溶血性弧菌的快速检测提供了新的发展方向。2.建立了海产品中副溶血性弧菌的LAMP检测系统(包括优化后的LAMP方法、副溶血性弧菌核酸检测试剂盒以及Deaou-308℃恒温荧光检测仪),该检测系统方便快速、特异性强、灵敏度高,适用于海产品中副溶血性弧菌的快速检测。