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铁皮石斛为传统名贵中药材,因其突出的滋阴功效而受到历代医家的推崇。我国幅员辽阔,铁皮石斛产区较多,早在北宋《本草图经》中关于石斛的记载就有“春州石斛”和“温州石斛”的区别,说明古人早已从性状上发现不同产地铁皮石斛存在差别。2015版《中国药典》以多糖为重点建立铁皮石斛质量标准,但多糖缺乏特异性,不能作为鉴别不同产地铁皮石斛的标志性成分。黄酮成分亦是铁皮石斛的主要成分,具有抗氧化、抗肿瘤等生物学活性,同时也是植物抵御外界胁迫的重要成分。课题组大量野外考察发现不同道地产地的铁皮石斛性状有所不同,进一步对不同产地铁皮石斛进行了多个成分的含量测定,并根据含测结果进行了多元统计分析,主成分分析和聚类分析结果一致,广东、福建、江西等丹霞地貌的样品（丹霞种）聚为一类,广西云南（铁皮兰种）的样品聚为一类,浙江本地的样品（浙江本地种）聚为一类。含量测定结果的聚类分析与课题组前期通过特征图谱相似度评价的分类结果一致,说明将不同产地铁皮石斛分为3个种源是合理的。因此,本研究选取广东韶关产铁皮石斛代表丹霞种源,广西桂平产铁皮石斛代表铁皮兰种源,浙江雁荡产铁皮石斛代表浙江本地种源,以这3个主要道地产地的样品为依托对道地产地铁皮石斛进行转录组测序和液质特征图谱研究。目前关于铁皮石斛的研究主要集中于多糖,关于其黄酮成分的合成途径、以及不同产地黄酮成分种类和含量的差异报道较少。本研究以期能完善铁皮石斛酶基因数据库,为更好的了解铁皮石斛黄酮合成途径供理论依据。目的:建立不同产地铁皮石斛样品图片库;进而收集不同产地铁皮石斛,进行高通量测序,比较广东、广西、浙江3个产地铁皮石斛转录组数据差异,筛选与黄酮合成途径相关的基因;采用超高效液相色谱串联离子阱飞行时间质谱仪（UHPLC-ESI-MS）解析不同产地铁皮石斛黄酮成分的结构,寻找能够鉴别不同产地铁皮石斛的标志性成分;综合分析不同产地铁皮石斛黄酮含量与其合成途径相关基因表达量之间的关联,为今后能利用生物技术调控铁皮石斛黄酮成分积累提供基础。方法:1.考证主流本草对铁皮石斛的产地记载,实地考察铁皮石斛传统道地产区。2.应用高通量测序技术对广东、广西、浙江3个产地的铁皮石斛进行转录组测序,获得铁皮石斛大量基因信息。3.采用UHPLC-ESI-MS技术,解析不同产地铁皮石斛黄酮结构。4.基于转录组测序和黄酮含量测定,探讨铁皮石斛黄酮成分生物合成的分子机理。结果:1.实地考察了广东韶关、广西桂平、浙江温州等铁皮石斛传统道地产区,记录了铁皮石斛原生态生长环境,收集了多产地铁皮石斛样品,建立了不同产地铁皮石斛图片库。2.基于高通量测序对广东、广西、浙江3省所产铁皮石斛进行转录组测序。三个产地获得的unigene过滤后,GC含量为42.2292%,拼接组装后总共得到49095条unigene,平均长度为896 bp,N50为1613 bp。获得的序列信息与已知的Nr、GO、KEGG和KOG四大常见数据库进行了比对,有25737条unigenes得到功能注释,占所得unigene基因的52.42%。其中25203条unigenes被比对到Nr数据库,占51.33%;比对到KEGG数据库的unigene基因有9758条,占19.88%;被KOG数据库比对到的unigene基因有15845条,占32.23%。对三个产地转录本的差异表达基因进行比较分析,广东和浙江的差异表达表现为上调的有2209条,下调的有1174条;广东和广西的样品,有3540条差异表达基因,包括1356条下调的unigene和2184条上调的unigene;浙江和广西的样品进行比较,检测到3416条差异基因,其中1476条unigene上调,1940条unigene下调。3.基于转录组测序获得的信息,筛选与铁皮石斛黄酮合成途径相关的基因。本研究筛选到42个unigene编码的酶可能参与黄酮类化合物生物合成,进行PATHWAY注释后,归属于13种参与调控黄酮类成分合成途径的酶,囊括了铁皮石斛代谢途径中除FNS外的其它所有参与黄酮类化合物生物合成途径的酶。此外,还分析了三个产地调控黄酮合成的转录因子、细胞色素P450和糖基转移酶的表达量。4.建立了铁皮石斛超高效液相色谱（UHPLC）特征图谱分析方法,采用UHPLC-ESI-MS技术对不同产地铁皮石斛黄酮成分进行了指认,对新西兰牡荊苷Ⅱ等9个黄酮苷进行了结构解析,总结了铁皮石斛黄酮苷质谱裂解规律。5.基于转录组测序获得的基因信息结合黄酮含量测定结果,推测铁皮石斛总黄酮的含量主要由F3’H和糖基转移酶73E1、At3g57200、87A1等酶基因决定。芦丁的生物合成的可能受F3’H和糖基转移酶基因73B5、86A1、83A1调节。糖基转移酶73E1、AT3g57200、87A1等基因可能参与异佛莱心苷的合成。ABC转运蛋白G亚家族以及一些CYP450基因在浙江样本中高表达,可能与浙江铁皮石斛新西兰牡荊苷Ⅱ含量较高相关。结论:1.通过实地考察铁皮石斛道地产区并收集不同产地的样品,发现不同产地的样品性状上确实有差异,结果与《本草图经》关于石斛的记载一致。2.基于转录组测序获得了铁皮石斛的大量基因信息,发现铁皮石斛黄酮合成不仅受黄酮途径相关酶调控,还与植物次生代谢产物合成相关的转录因子、细胞色素P450和糖基转移酶密切相关。3.采用UHPLC-ESI-MS对黄酮苷进行结构解析,发现铁皮石斛所含黄酮苷主要为以芹菜素为母核的碳苷和以槲皮素为母核的氧苷,其质谱裂解规律为石斛属其它植物黄酮成分结构解析奠定了基础。4.铁皮石斛黄酮含量与黄酮合成途径相关酶基因表达的相关性分析,为阐述石斛黄酮合成分子机理,及今后通过生物工程调控植物黄酮积累提供了理论基础。