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目的:探讨细胞色素P4502E1(CYP2E1)基因调控酒精诱导炎症因子在大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma,PC12)细胞的表达及中枢神经系统胰岛素抵抗的机制。方法:1、使用慢病毒技术在大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)系构建CYP2E1基因敲低的神经细胞模型(CYP2E1KD),用空载PC12细胞(CYP2E1WT)作为参照;2、给予酒精处理CYP2E1WT,使用实时定量PCR技术在不同的酒精浓度梯度及时间梯度的条件下检测CYP2E1mRNA表达;酒精浓度确定后,进一步采用免疫荧光技术测定CYP2E1蛋白表达。3、胰岛素信号通路中重要蛋白(蛋白激酶B:AKT)表达水平的测定:这两株细胞,被随机各分为四组:(1)空白对照组(C组);(2)空白对照+胰岛素组(100nM,C+I组);(3)酒精组(100 mM,A组);(4)酒精+胰岛素组(剂量同前,A+I组),使用免疫印迹(western blot:WB)技术检测胰岛素刺激时其信号通路的改变。4、建立酒精诱导炎症的细胞模型:这两株细胞,被随机各分为两组(1)空白对照组(C组);(2)酒精组(100mM,A组);在酒精处理24小时后,使用WB技术检测炎症信号通路IKKβ/NF-κB的变化,及qPCR技术检测CYP2E1、TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS mRNA表达;同时用活性氧检测试剂盒测ROS。结果:1.成功构建CYP2E1敲低的PC12神经细胞系。经q-PCR检测CYP2E1KD组CYP2E1 mRNA表达较对照组降低18倍(P<0.05),western blot检测蛋白表达亦明显降低。2、成功建立酒精诱导CYP2E1的细胞模型,经酒精浓度梯度及时间梯度的研究,发现在100mM,作用24h后CYP2E1 mRNA较非酒精处理组明显增加(P<0.05),同时免疫荧光检测证实CYP2E1蛋白表达增加;3、敲低CYP2E1基因可以减弱酒精对胰岛素信号通路(PI3K/AKT)的抑制作用:在CYP2E1WT细胞中酒精可抑制胰岛素刺激引起的胰岛素信号通路中关键酶蛋白激酶B(AKT)的磷酸化(p-AKT473);敲低CYP2E1基因可改善酒精引起的PC12细胞胰岛素抵抗。给予胰岛素刺激后,p-AKT473在两株PC12细胞中均高表达(P<0.05),且CYP2E1KD细胞与CYP2E1WT细胞间无明显差异;酒精处理后,p-AKT在CYP2E1WT细胞组明显被抑制(P<0.05),而在CYP2E1KD细胞中酒精对胰岛素信号通路的抑制被缓解。同样地,酒精处理后磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(P-AMPK)的表达在CYP2E1WT细胞中明显低于CYP2E1KD细胞(P<0.05)。4、在CYP2E1WT细胞中,酒精处理不仅引起CYP2E1 mRNA表达增加,而且同时激活NF-κB信号通路,引起炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA表达增高;而敲低CYP2E1基因可抑制酒精引起的炎症反应。5、酒精处理增加氧化反应,活性氧(ROS)在CYP2E1WT细胞中明显增高,而敲低CYP2E1后,ROS表达无明显增加。结论:酒精导致中枢神经细胞(PC12细胞)CYP2E1 mRNA及蛋白表达量增加,导致胰岛素主要信号通路中关键蛋白:AKT、AMPK的磷酸化被抑制,从而引起胰岛素抵抗;在进一步研究酒精引起中枢神经系统胰岛素抵抗的机制时,我们发现酒精可导致神经细胞氧化应激反应增加,同时炎症信号通路IKKβ/NF-κB激活,使其重要信号蛋白NF-κB蛋白磷酸化增加,从而致炎性反应增高。而抑制CYP2E1的表达可抑制酒精导致的ROS增加及炎症因子的释放,从而降低胰岛素抵抗,但具体机制仍需进一步研究。