手性醇被广泛用于合成手性药物、精细化学品和农用化学品,是最重要的手性砌块之一。生物催化潜手性酮不对称还原合成手性醇因具有理论产率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为手性醇绿色合成的优选途径。然而,大多数生物催化剂还原潜手性酮的过程遵循Prelog规则,具有anti-Prelog立体选择性的生物催化剂相对稀缺。鉴于此,本论文以开发高效的anti-Prelog立体选择性生物催化剂为目标,开展了包括菌种筛选、基因挖掘、蛋白表达、酶催化性质表征和理性设计改造酶催化性能等方面的研究。利用传统菌种筛选策略,从土壤中分离得到具有anti-Prelog立体选择性的微生物菌株ZJUY-1401;经形态学观察、生理生化鉴定和系统发育分析,确定该菌株为短稳杆菌(Empedobacter brevis)。短稳杆菌ZJUY-1401能够高立体选择性不对称还原一系列苯乙酮衍生物,催化底物谱宽泛；另一方面,该菌株可利用相对廉价的NADH作为辅酶,且能够以乙醇作为辅底物实现辅酶再生,具有良好的乙醇耐受性和pH适应性,因而具备了anti-Prelog手性醇高效合成工具的潜质。通过基因组狩猎法分别从E. brevis ZJUY-1401和Pseudomonas putida ATCC12633基因组中挖掘并克隆了羰基还原酶基因Ebsdr8和Ppysdr,并成功实现了相应编码蛋白EbSDR8和PpYSDR在E. coli BL21(DE3)中的异源表达。氨基酸序列分析表明两者均属于短链脱氢酶家族,具有该家族蛋白高度保守的富甘氨酸“指纹”序列GXXXGXG,催化三联体Ser-Tyr-Lys和活性位点模体YXXXK。 EbSDR8不对称还原苯乙酮的产物为(R)-苯乙醇,ee值高达99.9%；而PpYSDR催化苯乙酮还原的主要产物为(S)-苯乙醇,ee值为84.2%。为了便于在后续研究中深入认识两个酶催化性能和结构间关系,通过同源建模分别构建了具有高可信度的三级结构模型,两者均具有短链脱氢酶家族蛋白典型的Rossmann折叠结构。考察EbSDR8和PpYSDR的酶学性质发现,两者均可利用NADH和NADPH作为辅酶催化潜手性酮的还原,但NADH作为辅酶时的催化性能优于NADPH;两者均能以异丙醇作为辅底物实现辅酶再生进而加速反应进行。EbSDR8和PpYSDR的最适反应温度分别为35℃和30℃,最适反应pH均为7.5；值得注意的是,EbSDR8能够在较宽pH范围(7.0～10.5)催化反应进行,具有良好的pH适应性。另一方面,EbSDR8和PpYSDR重组大肠杆菌全细胞能够在无外源辅酶添加的体系中高效催化一系列潜手性酮的不对称还原,但其立体选择性相反,分别遵循anti-Prelog和Prelog规则；分子水平的分析表明,两者底物结合口袋几何构型和大小的显著差异是导致其立体选择性不同的关键因素,底物结合口袋的几何构型决定了底物的结合模式和取向定位,而结合口袋大小则影响了底物分子的自由旋转,两者共同决定了酶的立体选择性。基于对EbSDR8和PpYSDR底物结合口袋几何构型和氨基酸残基组成的比较及分子对接结果的分析,制定了减小空间位阻并建立／消除分子间相互作用的酶立体选择性调控策略。该策略的运用成功将PpYSDR还原一系列卤代苯乙酮的立体选择性从遵循Prelog规则转变为遵循anti-Prelog规则,特别是突变体M85T/L136E和M85V/M187D还原3’,5’-双(三氟甲基)苯乙酮以及M85T/W182V和M85V/L136V还原2,2,2-三氟苯乙酮的立体选择性完全反转,相应anti-Prelog手性醇ee值达95%以上。通过分子对接逆向分析发现,突变位点的引入确实有效地执行了所设计的立体选择性调控策略,空间位阻的变化以及芳香环和卤素原子参与的分子间作用力在酶立体选择性反转的发生和稳定中发挥了重要作用。利用理性设计实现PpYSDR立体选择性反转不仅有助于加深对此类酶立体选择性调控机制的理解,同时也拓宽了anti-Prelog立体选择性生物催化剂的来源。通过详细分析潜手性酮与EbSDR8分子对接结果,选取可能影响EbSDR8催化活性的氨基酸残基作为突变位点,并根据所选位点的氨基酸残基性质、与底物间的相互作用和对底物结合口袋构型的影响等,有针对性地设计了一系列突变体。所设计的单点突变G94A和S153L分别提高了EbSDR8的催化活性,且这两个位点的突变对催化活性的提高表现出明显的协同效应,其组合突变G94A/S153L还原潜手性酮的催化效率显著提高,特别是其还原苯乙酮和4’-甲氧基苯乙酮的催化效率均达到野生型EbSDR8的15倍以上。分子对接和动力学模拟结果表明,活性口袋空间位阻的增加和酶-底物分子间C—H…π非键弱相互作用的引入在EbSDR8突变体活性提高中发挥了重要作用。此外,突变体G94A/S153L全细胞在不添加外源辅酶的情况下,能够以异丙醇作为辅底物,有效催化高浓度2,2,2-三氟苯乙酮还原合成小胶质细胞活化有关疾病治疗药物的重要手性中间体(S)-2,2,2-三氟-1-苯乙醇,表明该全细胞生物催化剂具有广阔的应用前景。