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肿瘤中部分关键基因的表达水平与正常组织相比存在显著性差异，这是肿瘤发生与发展过程中重要的生物学现象，这些异常表达的基因可作为肿瘤的生物标志物用于其早期诊断。生物传感技术因具有高灵敏度、高特异性、廉价高效、操作简单及可在复杂体系中稳定检测等特点而在肿瘤标志物分子检测方面被寄予厚望。近年来，纳米材料与核酸探针的发展与联合应用为生物传感技术发展注入了新鲜活力，且在mRNA/microRNA等肿瘤标志物分析领域广泛应用，这为肿瘤早期基因水平上的诊断提供了新思路和新尝试。本论文基于还原型氧化石墨烯(rGO)纳米材料及核酸探针，结合酶促放大效应，构建了应用于mRNA/microRNA体外标准检测和活细胞内实时成像的检测方法，实现了对血管内皮生长因子VEGFmRNA、miR-451a、miR-214-3p等重要mRNA/microRNA的高特异性、高灵敏度检测。具体内容如下：
1、基于rGO及DNA探针的DSN辅助的VEGFmRNA超灵敏检测
准确监测VEGFmRNA的表达水平有望用于肿瘤发病分子机理研究、药物筛选、临床诊断及预后评估。基于rGO对单双链核酸选择性吸附作用、对荧光染料分子荧光高效近距离猝灭效应以及双链特异性核酸酶(DSN )选择性切割DNA-RNA杂交链中DNA的特性成功构建了DSN辅助的P@rGO纳米探针，实现了VEGFmRNA的超灵敏检测。实验结果表明：在优化的检测体系中，rGO最适浓度为6μg/mL，Mg2+最适浓度为5mM，DSN最适浓度为2U/mL，DSN最适酶切温度为55℃，DSN充分反映时间为2h。以此纳米探针在最优化的实验条件下检测VEGFmRNA，线性浓度范围为100fM~1nM，检测限低至100fM，相较于非酶促放大反应，DSN辅助的检测体系检测限提高了4个数量级。此外，活细胞内VEGFmRNA的原位成像结果进一步表明DSN辅助的P@rGO纳米探针可实现细胞内VEGFmRNA的可视化动态监测。
2、基于rGO及DNA探针的miRNA定量分析方法的构建
miR-451a、miR-214-3p在多种类型肿瘤中异常表达，与肿瘤浸润转移密切相关，是评估肿瘤恶性程度的潜在标志物。基于rGO对单双链核酸选择性吸附作用及高效近距离猝灭荧光染料分子荧光的特性成功构建了P@rGO纳米探针，实现了体外均质溶液中miR-451a、miR-214-3p的单靶点高灵敏检测，实验结果表明：在优化的rGO浓度为3.5μg/mL条件下，可实现miR-451a1~100nM，miR-214-3p1~200nM浓度范围内的良好线性分析，二者检测限均低至1nM。在此经济、简单、高效的P@rGO纳米探针体外检测两种miRNA分子的基础上，我们期望进一步构建探针P1和P2双负载的P1&P2@rGO纳米探针以探索其在体外活细胞内miR-451a和miR-214-3p同步监测的能力，为开展体外活细胞内双靶标成像及更精确鉴定肿瘤恶性程度提供依据。
1、基于rGO及DNA探针的DSN辅助的VEGFmRNA超灵敏检测
准确监测VEGFmRNA的表达水平有望用于肿瘤发病分子机理研究、药物筛选、临床诊断及预后评估。基于rGO对单双链核酸选择性吸附作用、对荧光染料分子荧光高效近距离猝灭效应以及双链特异性核酸酶(DSN )选择性切割DNA-RNA杂交链中DNA的特性成功构建了DSN辅助的P@rGO纳米探针，实现了VEGFmRNA的超灵敏检测。实验结果表明：在优化的检测体系中，rGO最适浓度为6μg/mL，Mg2+最适浓度为5mM，DSN最适浓度为2U/mL，DSN最适酶切温度为55℃，DSN充分反映时间为2h。以此纳米探针在最优化的实验条件下检测VEGFmRNA，线性浓度范围为100fM~1nM，检测限低至100fM，相较于非酶促放大反应，DSN辅助的检测体系检测限提高了4个数量级。此外，活细胞内VEGFmRNA的原位成像结果进一步表明DSN辅助的P@rGO纳米探针可实现细胞内VEGFmRNA的可视化动态监测。
2、基于rGO及DNA探针的miRNA定量分析方法的构建
miR-451a、miR-214-3p在多种类型肿瘤中异常表达，与肿瘤浸润转移密切相关，是评估肿瘤恶性程度的潜在标志物。基于rGO对单双链核酸选择性吸附作用及高效近距离猝灭荧光染料分子荧光的特性成功构建了P@rGO纳米探针，实现了体外均质溶液中miR-451a、miR-214-3p的单靶点高灵敏检测，实验结果表明：在优化的rGO浓度为3.5μg/mL条件下，可实现miR-451a1~100nM，miR-214-3p1~200nM浓度范围内的良好线性分析，二者检测限均低至1nM。在此经济、简单、高效的P@rGO纳米探针体外检测两种miRNA分子的基础上，我们期望进一步构建探针P1和P2双负载的P1&P2@rGO纳米探针以探索其在体外活细胞内miR-451a和miR-214-3p同步监测的能力，为开展体外活细胞内双靶标成像及更精确鉴定肿瘤恶性程度提供依据。