论文部分内容阅读
目的:用转染慢病毒载体的方式改变不同胃癌细胞株中KAI1基因的表达量,探讨KAI1基因对胃癌细胞体外生长与迁移能力的影响。方法:1.将人低分化胃癌细胞BGC823分组,分别为转染KAI1基因过表达慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-KAI1-3Flag的实验组(BGC823-OE组)、转染空病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS的阴性对照组(BGC823-NC组)和未做特殊处理的空白对照组(BGC823-Ctrl组);同时将人高分化胃癌细胞MKN28进行分组,分别为转染KAI1基因慢病毒RNA干扰载体pLKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-shRNA(KAI1)的实验组(MKN28-siRNA组)、转染空病毒载体pLKD-CMV-EGFP-Puro-U6-shRNA的阴性对照组(MKN28-NC组)以及未做特殊处理的空白对照组(MKN28-Ctrl组),病毒感染72小时后荧光显微镜下观察各组细胞中绿色荧光蛋白EGFP的表达,并通过加药筛选方法建立稳定转染的细胞株。2.应用蛋白印迹实验(Western Blot,WB)和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测各组细胞株中KAI1蛋白和mRNA的表达情况。3.四唑盐比色法(MTT)检测各组细胞株的体外生长增殖情况。4.流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测各组细胞株细胞周期的改变情况。5.采用Transwell实验检测各组细胞株体外迁移情况。结果:1.各组细胞慢病毒感染72h后,荧光显微镜下观察到两种胃癌细胞实验组和NC组中有大量荧光蛋白EGFP的表达,而Ctrl组中未观察到绿色荧光的表达,用加药筛选的方法成功扩增构建出实验组与NC组的稳转细胞株。2.BGC823-OE组中的KAI1蛋白以及mRNA的相对表达量显著高于BGC823-NC组及BGC823-Ctrl组(P<0.05);而MKN28-siRNA组中的KAI1蛋白以及mRNA的相对表达量显著低于MKN28-NC组及MKN28-Ctrl组(P<0.05);两种细胞的NC组与Ctrl组中的KAI1蛋白和mRNA的相对表达量差异之间无统计学意义(P>0.05)。3.BGC823-OE组在24h、48h、72h的相对增殖率明显低于BGC823-NC组以及BGC823-Ctrl组在同时段的相对增殖率,且差异具有显著性(P<0.05);而MKN28-siRNA组在24h、48h、72h的相对增殖率则明显高于MKN28-NC组以及MKN28-Ctrl组在同时段的相对增殖率,差异同样具有显著性(P<0.05);两种细胞的NC组与Ctrl组在24h、48h、72h的相对增殖率之间的差异无统计学意义(P>0.05)。4.BGC823-OE组细胞周期的S期占比明显少于BGC823-NC组以及BGC823-Ctrl组,差异具有显著性(P<0.05);MKN28-siRNA组细胞周期S期占比则明显多于MKN28-NC组以及MKN28-Ctrl组,差异同样具有显著性(P<0.05);两种细胞的NC组与Ctrl组S期比例之间差异无统计学意义(P>0.05)。5.BGC823-OE组细胞的迁移数目要明显少于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组,差异有显著性(P<0.05);MKN28-siRNA组细胞迁移数目则多于 MKN28-NC组和MKN28-Ctrl组,差异有显著性(P<0.05);两种细胞的NC组与Ctrl组细胞迁移量差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.成功构建稳定高表达KAI1基因的人胃癌BGC823细胞株以及稳定低表达KAI1基因的人胃癌MKN28细胞株。2.上调KAI1基因的表达量可以抑制BGC823细胞株的体外增殖与迁移;下调KAI1基因的表达量可以促进MKN28细胞株的体外增殖与迁移。3.KAI1基因可将胃癌细胞生长周期阻滞于G0G1期。4.KAI1基因对不同胃癌细胞株体外生长与迁移能力具有负向调控作用。