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[目的]卒中是全球人口死亡和残疾的主要原因,其发病机制十分复杂。缺血性卒中是最常见的卒中类型,约占全部卒中的87%。血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)是位于血液与脑组织之间的一个选择性通透的屏障体系,严格控制血管两侧的物质转运,从而维持中枢神经系统(central nervous system, CNS)内环境的相对稳定。卒中后BBB破坏直接影响CNS功能,导致血管源性脑水肿、出血性转化和神经元凋亡,加重神经功能缺损。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的激活被认为是破坏BBB结构和功能的重要分子机制。脑缺血时,基质金属蛋白酶-2(matrix metal loproteinase-2, MMP-2)可能通过降解内皮细胞紧密连接蛋白和基底膜成分使血管壁完整性破坏。发热是卒中患者早期常见并发症,有研究发现发热可加重卒中患者预后,而具体机制还未阐明。因此,研究发热加重卒中后脑损伤的机制,以及发热是否上调MMP-2表达而加剧对BBB紧密连接蛋白的损伤,就具有一定现实意义。为此,本课题通过原代培养SD大鼠乳鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞,建立简便、易行的能够模拟在体BBB的体外细胞模型。予以外源性添加MMP-2和发热处置干预,分析BBB模型紧密连接蛋白occludin的变化,从而探索MMP-2及发热在脑缺血后BBB破坏方面可能的作用机制,为临床缺血性卒中患者并发症的防治提供理论依据。[方法]以SD大鼠乳鼠为实验材料,采用酶消化法原代分离、纯化、传代培养获得脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞,倒置显微镜下观察细胞的形态。经过HE染色,免疫荧光鉴定细胞及其纯度,使用培养3代的两种细胞通过Transwell小室进行共培养,构建体外BBB接触模型。并通过渗漏试验和LY渗透性测定,鉴定模型屏障功能。将构建成功的模型随机分为37℃常温、39℃发热、37℃常温+MMP-2、39℃发热+MMP-2四组,进而采用免疫细胞化学法和western blot方法观察各组模型中BBB紧密连接蛋白occludin的变化。同时用免疫细胞化学法检测37℃常温及39℃发热条件下星形胶质细胞MMP-2的表达。[结果]1.对分离培养的脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞进行了形态学观察,呈现出各自典型的生长特征。经HE染色和免疫荧光法鉴定,细胞纯度达95%以上,符合两种细胞共培养的实验要求。2.两种细胞通过Transwell小室进行共培养,成功建立与12孔板相匹配的BBB接触模型。选择镜下细胞完整融合的模型进行4h渗漏试验,结果成阳性。LY渗透性检测模型具有低通透系数(permeability coefficient, Pe),其值为0.95 ±0.06×10-3cmin。3.免疫细胞化学法显示,相同时间点39℃发热组星形胶质细胞MMP-2阳性表达细胞数较37℃常温组增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中,39℃发热组随着处置时间的延长,星形胶质细胞MMP-2阳性表达细胞数亦增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.免疫细胞化学法和Western blot显示,相同时间点37℃常温+MMP-2组与37℃常温组比较,内皮细胞occludin的表达在60min和90min时均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。且37℃常温+MMP-2组随着处置时间的延长,内皮细胞occludin的表达有下降趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.免疫细胞化学法和Western blot显示,相同时间点39℃发热+MMP-2组与39℃发热组比较,内皮细胞occludin的表达在60min和90min时均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。且39℃发热+MMP-2组随着处置时间的延长,内皮细胞occludin的表达有下降趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.免疫细胞化学法和Western blot显示,相同时间点39℃发热组内皮细胞occludin的表达较37℃常温组下降,差异有统计学意义(P<O.05)。且39℃发热组随着处置时间的延长,内皮细胞occludin的表达有下降趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.免疫细胞化学法和Western blot还显示,相同时间点39℃发热+MMP-2组内皮细胞occludin的表达较37℃常温+MMP-2组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.原代分离、培养出了SD大鼠乳鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞,并成功建立了符合实验需要的体外BBB接触模型。2.体外培养的星形胶质细胞可表达MMP-2,发热可上调星形胶质细胞MMP-2的表达。3.37℃常温下,外源性添加MMP-2可降低体外BBB模型内皮细胞紧密连接蛋白occludin的表达,并随时间的延长而加剧。4.39℃发热条件下,体外BBB模型内皮细胞紧密连接蛋白occludin的表达下调,并随时间的延长而加剧。5.发热进一步加剧MMP-2对体外BBB模型内皮细胞紧密连接蛋白occludin的下调,并随时间的延长而加剧。6.发热可能通过上调MMP-2的表达从而加剧体外BBB模型的破坏。