目的沙雷菌（Serratia）是临床常见的机会致病菌之一。近年来,因其临床菌株易对常用抗生素产生耐药性,且偶可导致院内感染的爆发,故而逐渐引起人们的重视。细菌中成簇规律性间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas）和毒素-抗毒素（TA）系统分别以特异性切割降解核酸序列及顿挫感染的方式发挥噬菌体防御的功能,前者被认为可影响移动元件在细菌间的水平转移,后者则与细菌对不良环境的耐受有关。本研究旨在对沙雷菌CRISPR-Cas系统及Ⅱ型TA系统的结构和分布特征进行系统分析,研究其与沙雷菌的可移动元件、耐药基因及耐药表型的关系;同时,探究部分TA系统表达后对细菌生长产生的影响。方法1.自Nucleotide数据库下载了88株沙雷菌的全基因组序列,使用CRISPRCasfinder软件预测基因组所含CRISPR阵列及cas基因簇;由Meg Aline软件进行cas基因的序列比对并构建系统发育树;由DNAMAN8分析前导序列的AT碱基含量和序列,并使用BPROM预测启动子;所得重复序列与CRISPRmap数据库进行比较分析,使用RNAfold预测其最小自由能（MEF）及二级结构;由Blast N和CRISPRTarget进行间隔序列靶向基因的预测;使用PHASTER、ICEfinder、Ori Tfinder、CARD等软件分别对前噬菌体、整合接合元件（ICE）、可接合转移质粒及菌株所含耐药基因进行预测,并分析其与CRISPR-Cas系统之间的关联。2.使用TAfinder预测上述菌株基因组中所含Ⅱ型TA系统,并将所得毒素与抗毒素分别构建数据库,根据Blast P的E-value值再分组,将TA系统重新配对组合,分析其操纵子特征;由Origin软件展示新组合的TA系统在沙雷菌中的分布情况;确定沙雷菌TA系统的侧翼基因,同时预测染色体中的基因组岛（GI）、ICE、前噬菌体的位置以分析TA系统与移动元件的关系。3.基于上述分析结果设计Ⅰ-E、Ⅰ-F型cas1基因及10对TA系统的扩增引物,对收集的98株黏质沙雷菌临床分离株进行鉴定,分析这些系统的存在与细菌耐药表型之间的关系。4.将上述10对TA系统中的毒素与部分抗毒素编码基因的扩增产物分别连接至p BAD33与p ET28表达载体中,使其在大肠埃希菌Top10株及BL21株中单独表达、共同表达,以初步验证其生物学功能。5.统计学分析由SPSS 20.0完成,差异分析主要采用卡方检验及非参数秩和检验。结果1.本研究共在17株（19.32%）沙雷菌的全基因组序列中预测到41个确定的CRISPR阵列;9株菌（10.23%）同时含有cas基因簇。CRISPR-Cas系统型别主要为Ⅰ-E或Ⅰ-F型,cas基因簇中的cas1基因序列最为保守,其系统发育与CRISPRCas系统分型一致。前导序列保守性低,富含“AAAA”及“TTTT”序列,且多数都预测到启动子的存在。41个CRISPR阵列含14种重复序列,它们在型别内高度保守、序列差异较小,且都可以形成稳定的“茎环”结构。间隔序列多在30～34bp之间;靶向分析发现大多数与噬菌体同源,少数与质粒同源,这些质粒和噬菌体多来自肠杆菌科。含完整CRISPR-Cas系统沙雷菌的前噬菌体数量显著低于仅含CRISPR阵列组及不含CRISPR阵列组,但ICE在上述组别中的分布无差异;仅含CRISPR阵列沙雷菌可接合转移质粒存在率较高。沙雷菌染色质携带的耐药基因多为自主突变或固有存在,可移动的耐药基因主要分布于质粒,这些耐药质粒的存在与其CRISPRCas系统并无关联。2.TAfinder共在沙雷菌中预测出1820个Ⅱ型TA系统、31个Ⅳ型TA系统和182个外排泵组分相关的蛋白序列,菌株间所含TA数量的差异较大,在6～32个之间。沙雷菌TA系统的毒素序列可被分为16大类50类,其中Rel E类和GNAT类所含数量较多。抗毒素多为转录调节物,以RHH和Xre家族居多,可被分为53类,其蛋白序列和结构域较毒素更加复杂多变。沙雷菌的TA系统被重新分为78种,并进一步归为16类,其在沙雷菌中的分布极不均匀,系统结构也高度复杂多变。沙雷菌中的Ⅱ型TA系统大多位于染色体上,同一系统在同一菌种内具有相似的基因背景;少部分位于质粒、前噬菌体、GI等可移动元件上,可随之进行水平转移。3.仅1株临床黏质沙雷菌（1%）扩增出cas1基因;10对TA系统在临床分离菌中的存在率与数据库大致相符;耐药菌所含TA系统的数量明显低于非耐药菌,该差异由Rel1、Rel2、Ccd AB、Hic AB、GNAT、MNT/HEPN 6对TA系统所致。4.临床菌株中所含的Ⅱ型TA系统序列与数据库中序列有较高相似度。TA系统的初步功能验证发现Rel1、Rel2、Rel3、PIN1、PIN2、Hic AB系统的毒素对Top10菌株生长有抑制作用,Rel1、Rel2、Rel3、PIN2系统的毒素对BL21菌株生长有抑制作用,其中Rel1和PIN2系统的毒性作用可被其同源抗毒素在一定程度上中和。结论沙雷菌CRISPR阵列与完整CRISPR-Cas系统存在率明显低于细菌平均水平;系统类型主要为Ⅰ-E和Ⅰ-F型,与多数肠杆菌科细菌一致;重复序列保守,间隔序列多与噬菌体、质粒等同源。沙雷菌CRISPR-Cas可在一定程度上减少前噬菌体含量,但对可移动接合质粒、ICE及耐药基因无影响。Ⅱ型TA系统在沙雷菌中分布普遍、数目较多,大部分位于细菌染色体的固有位置,其序列和结构都高度复杂多变。临床黏质沙雷菌CRISPR-Cas系统的携带率低,10对TA系统存在率与数据库中大致相符,且TA数量与菌株耐药之间存在一定关联。异位表达初步验证了10对TA系统的生物学功能,6种毒素具明显毒性,为进一步分析表征及功能探究奠定了基础。