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L-精氨酸是一种重要的化学物质,常被应用于医药、食品、农副产品精加工等行业,尤其在肿瘤癌症治疗等方面应用价值显著。大肠杆菌（Escherichia coli）是一株革兰氏阴性菌株,具有发酵培养时间短,代谢网络清晰,基因编辑技术流程简单,大规模生产成本低,外源基因表达应用广泛等优点。因此,本研究选择大肠杆菌为宿主菌株进行代谢改造,通过加强目标产物主要合成途径碳代谢流通量,削减支路分解代谢途径,强化乙酰辅酶转化和乙醛酸循环途径,增加前体物合成等方法,构建一株能有效积累L-精氨酸的重组大肠杆菌菌株。（1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大肠杆菌进行代谢改造,首先敲除L-精氨酸阻遏蛋白Arg R编码基因arg R,解除阻遏蛋白对L-精氨酸合成途径的反馈阻遏作用实现L-精氨酸的积累。ARG-1经过摇瓶发酵48 h后产量达到1.2 g·L-1,与出发菌株相比,敲除菌株ARG-1解除了反馈阻遏后开始积累L-精氨酸,为后期优化L-精氨酸产量奠定了基础。敲除L-精氨酸支路途径编码基因adi A,spe A,spe F,spe C,ast A,gad A,gad B,削弱了L-精氨酸合成的竞争性代谢支路,使中心碳源更多流向目标产物,减少目标产物所需前体物的消耗,积累的共同前体物朝着L-精氨酸方向合成。ARG-8重组菌株摇瓶发酵后产量达到3.1 g·L-1,与ARG-1相比,提高了139.06%。（2）将重组菌株内N-乙酰谷氨酸合酶（NAGS）编码基因arg A的H15,Y19位点碱基序列进行定点突变,解除L-精氨酸对NAGS的反馈抑制,并异源表达L-精氨酸主要合成途径8个关键酶基因arg A～H,构建了菌株ARG-13。通过摇瓶发酵培养后产量到达7.9 g·L-1,比ARG-8菌株产量提高了160.79%,这表明增强L-精氨酸合成关键酶基因的表达水平,能有效增加合成途径碳代谢流,提高L-精氨酸产率。在菌株ARG-13上依次整合异源基因car AB、arg O,构建了ARG-14,ARG-15重组菌株,提高了重组菌株中L-精氨酸合成前体物氨甲酰磷酸和L-精氨酸的分泌运输,摇瓶发酵48 h,ARG-14,ARG-15的产酸能力达到8.0,8.8 g·L-1。通过敲除icl R基因,解除了Icl R蛋白对乙醛酸循环途径ace BAK操作子抑制,增强了TCA循环补充途径,构建ARG-16重组菌株。摇瓶发酵48 h后,产量达到9.0 g·L-1。（3）为了有效利用乙酸优化乙酰辅酶A代谢通量,并减少菌株生长副作用,强化L-精氨酸的合成,在重组菌株中异源表达乙酰辅酶A合成酶ACS编码基因acs。分别克隆表达及纯化四种不同细菌来源的ACS,通过比较酶学性质和动力学参数,发现Acetobacter pasteurianus ATCC 33445来源的Ap ACS1酶活最高为784.59 U·m L-1,最适反应p H为7.0,最适反应温度为37℃,与其他三种ACS来源相比,Ap ACS1具有更好的p H和温度稳定性。于是选择A.pasteurianus来源的acs1整合至重组大肠杆菌,菌株ARG-17摇瓶发酵48 h后,可生产9.5 g·L-1 L-精氨酸,比ARG-16中L-精氨酸积累量提高了6.3%。这表明Ap ACS1在为L-精氨酸生产提高乙酰辅酶A代谢通量方面具有一定的应用潜力。（4）在ARG-17中整合了6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf,提高了重组菌株中精辅酶NADPH的供应,同时节约了ATP的消耗,ARG-18的胞内NADPH、ATP水平分别为410.34,1550.64 nmol·g-1·DCW-1,比出发菌株提高193.38%和602.67%,ARG-18摇瓶发酵产量为9.8 g·L-1,有效提高了胞内NADPH的供应,强化了L-精氨酸的合成。将重组大肠杆菌ARG-18进行5 L发酵罐研究,对发酵48 h过程中的发酵系数进行检测。从实验结果中可知,发酵结束后,L-精氨酸产量为32.2 g·L-1,消耗了104 g葡萄糖,糖酸比为0.31 g·g-1葡萄糖,产率为0.74 g·L-1·h-1,为工业化氨基酸的生产提供了一定的参考依据。