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奶业已成为中国畜牧业的支柱产业。随着奶牛产奶量的不断提高,以及部分奶牛场及农户对奶牛的饲养管理不科学,奶牛代谢疾病也随之增多。奶牛酮病是由产后能量供需不平衡,引起脂肪和碳水化合物代谢紊乱,导致的一种全身功能失调性疾病。可致产奶量减少、奶质变差并影响后代素质,奶牛淘汰率升高等,给畜牧业造成较大的经济损失。为探讨酮病奶牛围产期能量代谢负平衡状态对乳汁蛋白组学的影响,研究酮病奶牛能量代谢负平衡与乳汁蛋白组学变化特征之间的关系,并获得酮病奶牛乳汁蛋白组学图谱,寻找酮病奶牛乳蛋白中的早期监测标志物。本实验通过非标定量(Label-Free)蛋白组学方法,对酮病奶牛乳脂球膜蛋白和乳清蛋白分别进行检测,结合生物信息学分析,获得了奶牛乳汁全蛋白图谱,并分析了酮病对牛乳蛋白组成的影响。随后,选择了炎症相关乳脂球膜蛋白进行ELISA验证。在黑龙江省中部地区某千头奶牛存栏量的集约化牧场,选取60头产前14-21天奶牛收集血液,分娩后每3天于清晨榨乳前收集血液和乳汁一次,跟踪采集至产后第28天。分离乳脂和脱脂乳分别冻存。对血液丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),AST/ALT,碱性磷酸酶(ALP),总蛋白质(TP),葡萄糖(GLU),甘油三酯(TG),游离脂肪酸(NEFA)和β羟丁酸(BHBA)进行检测,并将血清BHBA浓度≥1.40 mol/L奶牛分为酮病组,血清BHBA<1.40 mol/L奶牛分为对照组,使用酮粉法进行确认。将酮病组和对照组奶牛的乳脂和脱脂乳分别混匀后,分别提取乳脂球膜蛋白和乳清蛋白样品进行蛋白定量、SDS-PAGE电泳和胶内酶切,进行液相色谱-质谱/质谱联用(LC-MS/MS)蛋白组学检测,并进行三次技术重复。搜库后,筛选差异蛋白,进行生物信息学分析。确定了酮病对奶牛乳汁蛋白组学的影响。随后,对炎症相关乳脂球膜蛋白进行ELISA检测。同样根据血清BHBA浓度将奶牛分组。围产期内经历过酮病,血清BHBA水平≥1.40 mol/L的奶牛为酮病组,将围产期无酮病发病史,BHBA<1.40 mol/L且没有酮病临床症状的奶牛为对照组,并使用酮粉法进行确认。在酮病组奶牛分娩后的第7-14天,收集酮症发作前的样品为K1组,酮症组奶牛第14-28天的样品为K2。当酮病组奶牛产后超过28天,血液BHBA水平<1.40mol/L,收集的样品为K3组,作为酮病恢复后的样品。分娩后7-14天的对照组样品为C1组。在14-28天收集的对照组样品为C2组。分析获得了正常和酮病奶牛产后炎症相关乳脂球膜蛋白变化的规律。蛋白质组学研究结果显示,酮病组的乳脂球膜蛋白组分有402个蛋白上调和308个蛋白下调;乳清蛋白组分有22个蛋白上调和313个乳清蛋白下调。酮病导致了参与运输、信号转导、蛋白转运、囊泡介导的转运,发育成熟和免疫系统反应等生物过程均受到了很大影响。抗生素的生物合成、核糖体、内吞作用、内质网蛋白加工、癌症通路通路改变显著。对酮病奶牛炎症相关乳脂球膜蛋白的检测中发现,C2中的c4b结合蛋白α链(C4BPA),凝血酶原(F2),补体3(C3)和α-1-酸性糖蛋白(ORM1)显著高于K2组(p<0.05),而单核细胞分化抗原(CD14)显著降低(p<0.05)。K2中的α-inter-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4),补体9(C9),F2,α-2-HS-糖蛋白(AHSG)和补体调节蛋白变体4(CD46)显著高于K1(p<0.05),而CD14和CD46显著低于K1组(p<0.05)。K3组中ITIH4,F2和ORM1显著高于K1组(p<0.05),CD14显著低于K1组(p<0.05)。K1组的ITIH4,C4BPA,C3和CD46显著高于C1(p<0.05),而F2,AHSG和ORM1显著低于C1(p<0.05)。K2中的CD14和ORM1显著低于C2中(p<0.05),K3组中血清淀粉样蛋白A(SAA)和ORM1在显著低于K2(p<0.05)。且NEFA的浓度与BHBA、血液中C3、血液中C9、C3和ORM1水平显著相关。BHBA的浓度与血液中C3,TNFα,血液中C9,CD14,C3,和ORM1水平显著相关,GLU浓度与TNFα和ITIH4水平显著相关。我们发现,酮病时奶牛生产效率降低,能量负平衡导致肝功能受到损害。酮病导致奶牛能量代谢紊乱,乳腺分泌功能降低,乳汁免疫功能降低,部分阐明了能量负平衡导致乳汁蛋白变化的机制。证明奶牛酮病与围产期炎症相关代谢通路存在关系。酮病导致了牛奶中炎症相关乳脂球膜蛋白变化,引发了围产期奶牛乳腺炎症反应。本实验对于将来酮病的预测、预防和诊断,具有重要的意义和应用价值。