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细胞程序化死亡(PCD)是多细胞生物清除自身衰老、有危害或被侵染的细胞的一种机制,并且在植物的生长发育及对外界逆境的响应中行使重要功能。其中,植物与病原微生物互作过程中的过敏反应(hypersensitive reaction,HR)被认为是一种典型的PCD形式。DAD蛋白作为在动植物中结构保守的抗细胞凋亡因子,其在植物与病原菌互作过程中的功能了解尚不明确。本研究通过克隆大豆GmDAD1基因,对其表达模式及在大豆与疫霉非亲和互作过程中的功能进行研究。获得以下结果: 1.大豆GmDAD1基因克隆 从大豆中分离出GmDAD1 cDNA序列,全长351bp,编码的蛋白质在动植物中均十分保守,具有3个疏水性跨膜区域。qRT-PCR分析发现GmDAD1基因在大豆不同生育时期的根、茎、叶以及幼嫩的种子中均有表达。 2.大豆GmDAD1基因转录受疫霉侵染和干旱诱导 qRT-PCR的结果表明在大豆与疫霉的亲和(Williams和P6497)以及非亲和互作(Williams82和P6497)过程中,GmDAD1的转录水平均受疫霉侵染诱导上调表达。其中在非亲和互作过程中,GmDAD1诱导持续时间比亲和互作过程中长。用PEG6000和NaCl分别模拟干旱和高盐逆境处理大豆幼苗结果发现,GmDAD1基因受PEG6000诱导表达,而不参与植物对高盐胁迫的响应。 3.沉默GmDAD1影响大豆对疫霉抗性 利用发根农杆菌介导的大豆嵌合植株转化技术,获得GmDAD1基因沉默的大豆转基因根组织。抗病性分析的结果表明,在Williams82中沉默GmDAD1基因后,疫霉侵染位点的细胞死亡区域明显增加;台盼蓝染色的结果表明,菌丝能够在细胞间扩展;同时沉默组织中疫霉相对生物量增加,说明沉默GmDAD1使根组织对无毒疫霉菌株的抗性减弱。 4.沉默GmDAD1抑制互作过程中H2O2积累并干扰信号转导途径基因正常表达 本研究结果表明,沉默GmDAD1抑制了大豆与疫霉非亲和互作过程中H2O2的积累。同时对信号转导途径基因的表达分析表明,沉默GmDAD1抑制了PR1a、PR5以及ERF1基因在互作过程中的表达,同时促进了PDF1.2基因的表达。 以上结果表明,GmDAD1基因参与大豆与疫霉非亲和互作过程中的细胞死亡调控,同时干扰了抗病反应中信号通路的正常转导。