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水稻(Oryza sativa L.)是最主要的粮食作物之一,世界上有一半以上的人口以水稻为主食。使水稻减产的一个重要因素是病虫害,而稻瘟病是水稻最严重的病害之一,能使水稻产量降低11.0%-30.0%,甚至颗粒无收。防治稻瘟病最有效的方法是选育广谱抗稻瘟病的水稻新品种。挖掘水稻中的抗稻瘟病新基因,在应用分子辅助育种技术快速培育抗病新品种,是水稻遗传育种的常用方法。但由于田间稻瘟病病菌变异频繁,新培育的水稻抗病品种在应用推广几年后可能对稻瘟病的抗性减弱或者丧失。因此广谱抗病水稻新基因是水稻抗病新品种选育的宝贵资源。不断挖掘水稻抗稻瘟病新基因,尤其是广谱抗病基因,经过基因聚合培育广谱抗病水稻新品种,是水稻抗稻瘟病研究的一个重要方向。在前期研究中,在对一套抗稻瘟病近等基因系水稻材料进行重测序和比较基因组学分析的基础上,获得的一个水稻潜在的抗稻瘟病新基因OsHMA10。本文以近等基因系水稻材料Pi4b及其亲本CO39,及参照品种Nipponbare为材料,首先应用CRIPSR/Cas9、超表达等技术分析OsHMA10基因的抗病功能;然后应用亚细胞定位、基因共表达和蛋白质互作预测等技术,揭示OsHMA10基因的抗病作用机理。主要研究结果总结如下。1.以抗高毒性稻瘟病菌株GUY11的水稻材料Pi4b,使用CRISPR/Cas9技术获得OsHMA10基因的突变体,然后通过稻瘟病菌的接种试验发现OsHMA10基因Cas9突变体叶片病斑面积变大,表明突变体感稻瘟病。同时在感稻瘟病水稻品种Nipponbare中超表达OsHMA10基因的试验中,发现GUY11侵染7d后,超表达植株叶片病斑面积大幅度减少,说明超表达OsHMA10基因的植株抗病能力比Nipponbare增强。以上结果表明OsHMA10是水稻一个抗稻瘟病的新基因。从基因共表达GO分析的结果来看,OsHMA10共表达基因的“分子功能”GO term显著富集在GTP结合(GTP binding)和GTPase活性(GTPase activity)等term上。前人研究已揭示水稻抗稻瘟病的NBS-LRR类基因,主要通过NBS结构域结合GTP或ATP,参与抗病信号转导。OsHMA10具有HMA结构域可充当免疫识别受体蛋白(NLR)之间的整合域。有研究表明,通过Pikp-1的HMA结构域的整合,Pikp-1和Pikp-2实现了对稻瘟病菌效应物的识别,引起超敏反应,抑制稻瘟病菌的入侵,而OsHMA10的HMA结构域与Pikp-1的HMA结构域高度相似。从水稻OsHMA10基因的蛋白互作网络预测发现,OsHMA10基因编码的蛋白质与转录因子GRAS56和过氧化物酶prx125互作,水稻GRAS家族可以参与水稻对稻瘟病菌的响应,过氧化物酶可以调控水稻细胞内ROS的浓度,在水稻抵御稻瘟病的侵染中起着重要作用。因此可以推断,水稻OsHMA10基因抗病作用的机理是先通过其HMA结构域识别稻瘟病菌的效应物,结合富集在GTP途径的共表达基因传导稻瘟病菌胁迫的信号,再通过蛋白质间互作清除胞内自由基,以保护水稻植株免受伤害。2.在OsHMA10基因Cas9突变体水稻种植过程中发现,突变体水稻茎秆变脆易折断,进一步测量成熟期突变体水稻植株的茎秆厚壁组织细胞壁的厚度及其纤维素含量,发现突变体中细胞壁变薄,且纤维素含量降低。基因共表达网络及其GO富集分析,发现与OsHMA10共表达的基因中大部分富集在细胞组成(Cellular Component)中的高尔基体膜和细胞壁合成GO term上。同时蛋白质互作网络的预测也发现OsHMA10编码的蛋白质与调控高尔基体上物质运输的两个蛋白质GTP活化酶AGD9和ADP核糖基化因子(RAF)ARF互作。这些结果表明OsHMA10可能通过调控高尔基体膜上的物质运输以及细胞膜上的纤维素合酶来调控细胞壁上非纤维素糖和纤维素的合成,影响细胞壁的厚度和机械强度。总之,OsHMA10基因是通过其HMA结构域整合一个或者多个可以识别稻瘟病菌效应物的免疫识别受体蛋白来识别病原菌的入侵,结合富集在GTP途径的共表达基因传导稻瘟病菌胁迫的信号,再通过与其互作的蛋白质清除胞内自由基,以保护水稻植株免受稻瘟病菌入侵的伤害。OsHMA10基因还可以通过影响高尔基体中的非纤维素多糖的合成以及细胞膜上纤维素的合成来影响细胞壁的厚度,影响了水稻茎秆的机械强度,也加固了防御稻瘟病菌侵染的第一道屏障。基于稻瘟病菌入侵水稻的原理,细胞壁厚度的增厚可以抵御多种稻瘟病菌的入侵,那么OsHMA10基因有可能是一个广谱抗病的基因,这是接下来研究的一个方向。本文研究初步揭示水稻抗稻瘟病新基因OsHMA10抗病及其影响细胞壁合成的分子机理,为选育抗稻瘟病水稻新品种提供理论指导。