论文部分内容阅读
N-乙酰基转移酶（N-acetyltransferase,NAT,EC 2.3.1.5）是一种催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的酶。昆虫NAT主要与色素沉积、生理节律、几丁质的合成、杀虫药物的设计等有关。家蚕（Bombyx mori）是继果蝇之后又一典型的鳞翅目模式生物,还能作为生物反应器生产一些重要的药用重组蛋白。目前对家蚕N-乙酰转移酶基因（Bombyx mori NAT,BmNAT）的研究还比较少,关于BmNAT基因在家蚕中的基因调控机制还没有相关报导。我们根据已公布的家蚕N-乙酰基转移酶基因（Bombyx mori NAT,BmNAT）序列进行了生物信息学分析,该基因序列全长1690 bp,ORF为1065 bp,编码355个氨基酸残基,分子量大小为39.894kDa（GenBank登录号:XP004932777.1）,等电点pI为5.609;多序列比对的同源性分析表明,BmNAT与同是家蚕微管组织的其他BmNAT蛋白同源性较高,而与其他昆虫或者高等动物的NAT同源性较低,与BmNAT（GenBank登录号:XP004932776.1）的同源性最高;与玉带凤蝶（Papilio polytes）同源蛋白同源性最低。通过构建原核表达重组质粒pET28a-BmNAT,在大肠杆菌中表达融合蛋白,将重组质粒转化BL21（DE3）,IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE分析,在43 kDa左右有一条特异性蛋白条带,与预期大小（融合标签3.56 kDa,BmNAT 39.894 kDa）相符。经纯化蛋白并免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA测定抗体效价达到1:12800以上,Western blotting检测发现抗体特异性较高。分别提取家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织的总RNA和总蛋白,qRT-PCR和Western blotting检测BmNAT在家蚕各时期和各组织的表达情况,分析BmNAT的表达谱。结果表明,BmNAT在家蚕头部、蛾期、卵期的表达量较高,初步推断BmNAT可能在这些组织或时期中发挥一定的功能。亚细胞定位显示BmNAT主要存在于细胞质和细胞核中。通过构建重组真核表达载体pIEx-1-BmNAT,转染进入BmN细胞,过表达BmNAT蛋白,流式细胞术检测结果显示BmNAT对细胞周期可能存在一定的影响。前期研究表明,BmNAT存在乙酰化修饰,我们通过定点突变、免疫沉淀和Western blotting检测,进一步证实了BmNAT的乙酰化及其修饰位点。本研究首次证实家蚕乙酰化酶本身的乙酰化修饰,为认识家蚕新的基因翻译后修饰调控机理打下基础。