粘细菌作为一类重要的药源微生物类群,在新型活性天然产物发掘和创新药物研发中具有巨大的优势和潜力,例如纤维堆囊菌Sorangium cellulosum来源的活性天然产物epothilones和disorazoles,前者目前已进入临床应用阶段,后者目前主要处于临床前实验研究阶段,由于具有新颖的结构和显著的活性因而备受关注。Disorazoles具有大环双内酯类结构,能够通过抑制微管蛋白聚合,促进微管蛋白解聚,从而干扰细胞分裂,诱导细胞凋亡,是一类高效的抗有丝分裂化合物,对于多种肿瘤细胞系包括多耐药肿瘤细胞系均具有很强的生物活性,半抑制浓度在皮摩尔或钠摩尔水平。尤其是新发现的disorazole Z化合物,通过激素偶联已尝试进行肿瘤靶向化疗的临床实验研究,具有重要的研发和应用价值。由于disorazloles化合物同时存在杂环结构及不稳定的聚多烯结构,因此难以进行化学合成,且关于disorazole Z的生物合成研究至今也尚未有文献报道。Disorazole Z的原始产生菌So ce427生长缓慢且难以进行遗传操作,因而不适合大规模发酵以及生物合成途径的原位改造。本研究通过对其原始产生菌进行基因组测序和挖掘,发现和分析其生物合成途径,进而通过直接克隆和异源表达使其在易于操作的宿主中进行高效生物合成,同时对其生物合成途径进行理性设计和改造,以期阐明其生物合成机制,同时拟利用合成生物学或组合生物合成的方法得到新的disorazoles化合物或结构衍生物,以进行构效关系研究,从而筛选出符合临床应用需求的活性药物。除此之外,利用假单胞菌中的新型重组系统,对绿脓杆菌进行遗传改造开展抗感染研究的探索。主要研究成果总结如下:1、基于对纤维堆囊菌So ce 427的基因组测序,发现和分析了 disorazole Z的生物合成途径,并利用直接克隆技术将disorazole Z的生物合成基因簇整合到含有接合转移和转座元件的p15A复制子质粒上。2、通过电转化或接合转移以及转座,将基因簇整合到黄色粘球菌DK1622、伯克氏菌DSM7029和PG1基因组中尝试进行异源表达,其中在黄色粘球菌DK1622中检测到目标化合物以及系列结构衍生物的表达。3、对基因簇中的两个功能未知基因进行敲除,成功构建了基因敲除表达载体,为探索其在disorazole Z生物合成途径中的功能奠定基础。4、利用Red/ET重组工程技术对disorazole Z的生物合成基因簇进行启动子改造,成功构建了四环素诱导启动子调控,同时在trans-AT基因前插入组成型强启动子的表达载体,改造后的基因簇在异源宿主中的表达量有了显著提高。5、利用纤维堆囊菌So ce 12来源的disorazoles生物合成基因对disorazole Z生物合成途径中的基因进行互补或替换,成功构建了系列杂合基因簇表达载体,为探索化合物多样性的产生机制以及组合生物合成获得新的disorazoles化合物奠定了基础。6、利用假单胞菌中新型重组系统,对绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa PAO1进行基因组改造,成功构建和筛选获得了减毒菌株,为鼠李糖脂的工业生产或重组活菌疫苗的研发奠定了基础。本研究探索了重组工程技术在粘细菌来源活性天然产物生物合成途径的克隆、改造和异源表达,以及微生物基因组编辑和遗传修饰等领域中的应用。相关研究成果为活性天然产物发掘、抗肿瘤药物生物合成,以及抗感染疫苗的研发等后续工作奠定了基础。