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钙蛋白酶(Calpain,CAPN)作为影响肉嫩度的候选基因,在肌纤维生长发育和降解过程中发挥着至关重要的作用。Calpain3(CAPN3)是该家族的成员之一,在骨骼肌中特异表达,已有研究结果表明,CAPN3活性与肌纤维种类、肌纤维的收缩等密切相关,为此,我们推测CAPN3基因可能通过调控骨骼肌肌纤维生长发育从而影响肉品质,但目前关于CAPN3在鹅骨骼肌中的表达模式尚未见报道,同时,CAPN3在鹅肌骨骼肌生长发育过程中的表达调控机制也尚不清楚,这些问题都有待研究。为此,本试验以四川白鹅和钢鹅为试验材料,首先通过基因克隆的方法获得鹅CAPN3基因CDS区序列,然后采用HE染色法测定不同日龄鹅胸、腿肌肌纤维直径和密度,利用qPCR检测CAPN3基因和Cn-NFAT信号通路相关基因PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1在不同生长发育阶段肌肉组织中的表达情况,并分析了其表达量与肌纤维性状的关联性;最后在细胞水平上,通过在骨骼肌卫星细胞中干扰和过表达CAPN3基因,检测鹅肌肉生长发育过程中Cn-NFAT信号通路相关基因的mRNA变化情况,初步探讨了CAPN3基因在鹅骨骼肌生长发育中的作用。主要研究结果如下:(1)首次获得鹅CAPN3基因CDS区序列2316bp,该序列编码771个氨基酸,分子质量为89.019 kDa。序列比对表明,四川白鹅的CAPN3与日本鹌鹑、火鸡、珍珠鸡、鸭、鸽、鸡的CAPN3氨基酸序列的相似度达到90%以上。系统进化树分析表明,鹅CAPN3与鸟类有密切的遗传关系和较小的进化距离。(2)在胸肌中,两品种鹅CAPN3基因的表达量均呈“波浪线”的变化趋势。品种间对比发现,在不同胚龄(日龄)点,CAPN3 mRNA在四川白鹅胸肌中的表达量均明显较高于钢鹅(P<0.05)。腿肌中,CAPN3基因在两品种鹅发育过程中的表达量均呈“先上升后下降”的趋势。品种间对比发现,在不同胚龄(日龄)阶段,钢鹅在腿肌中的表达量均明显高于四川白鹅(P<0.05)。(3)两品种鹅CAPN3基因mRNA表达量与其肌纤维性状均呈不同程度的线性相关。在胸肌中,无论四川白鹅,还是钢鹅CAPN3 mRNA的表达量与其肌纤维密度均呈显著或极显著的正、负相关关系(P<0.05,P<0.01)。在腿肌中,四川白鹅CAPN3mRNA的表达量与其肌纤维密度呈显著负相关水平(P<0.05),而钢鹅CAPN3 mRNA的表达量与其肌纤维直径呈现极显著负相关水平(P<0.01)。(4)四川白鹅和钢鹅PPP3CA基因在胸肌中的表达均呈“先升后降”的趋势,而在腿肌中呈不同的表达模式。品种间比较发现,在E15、E22、49d和70d时,钢鹅在腿肌中的表达量均显著高于四川白鹅(P<0.05)。四川白鹅和钢鹅PPP3CB基因在胸肌中的表达均呈“降-升-降-升”的趋势,而在腿肌中的表达趋势一致。品种间比较发现,在不同胚龄(日龄)点,钢鹅PPP3CB基因在腿肌中的表达量均显著高于四川白鹅(P<0.05)。无论在胸肌或腿肌中,钢鹅PPP3R1基因的表达量均显著高于四川白鹅(P<0.05)。(5)鹅PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1基因与其肌纤维性状均呈不同程度的线性相关。两个品种鹅腿肌PPP3CA基因的表达与肌纤维直径和肌纤维密度呈正相关,但均未达到显著水平;两个品种鹅腿肌PPP3CB基因的表达与肌纤维直径呈显著负相关(P<0.05),而与肌纤维密度呈极显著正相关(P<0.01)。两个品种鹅腿肌PPP3R1基因表达量与肌纤维密度呈显著正相关(P<0.05)。(6)两品种鹅不同肌肉组织中CAPN3 mRNA表达量均与PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1基因的表达量呈极显著正相关(P<0.01)。(7)在CAPN3 siRNA干扰后的骨骼肌卫星细胞中,PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1基因的相对表达量均发生了显著的变化。PPP3CA、PPP3CB基因在干扰24h和72h时,其在干扰组的相对表达量均极显著和显著低于空白对照组和阴性对照组的表达量(P<0.01,P<0.05);而PPP3R1基因的相对表达量在三个时间点都是处理组低于另两个对照组,且均达到了极显著水平(P<0.01)。(8)在CAPN3基因超表达处理后的卫星细胞中,PPP3CA、PPP3CB基因在转染24h、48h、72h时,其过表达组的相对表达量与空白对照组和空载对照组相比均呈现显著或极显著的差异变化(P<0.05,P<0.01)。PPP3R1基因的表达量与另两个对照组相比均未有明显差异。综上所述,我们首次获得鹅CAPN3基因cDNA全长2316bp,同源性对比发现,鹅CAPN3蛋白的氨基酸序列与其他物种高度相似。CAPN3、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1基因在鹅不同肌肉组织中具有显著的差异表达并与鹅肌纤维特性间存在一定的相关性。在细胞水平上,CAPN3对鹅骨骼肌生长发育过程中Cn-NFAT信号通路中钙调磷酸酶基因具有正调控作用。所以我们推断CAPN3基因可能通过Cn-NFAT信号通路来调控肌肉生长发育。