新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起的禽类高致病性的病毒性疾病,其较高的发病率和死亡率给世界范围内的养禽业造成了巨大的危害。NDV属于副粘病毒科（paramyxoviridae）、禽腮腺炎病毒属（avulavirus）,是一种有囊膜的单股负链RNA病毒。深入研究NDV的入胞机制不仅可以使我们更好的理解、认识其致病机理而且还可以为开发特异性抗病毒药物提供新的思路以及理论支持。钙离子(Ca²⁺)作为细胞内最重要的第二信使之一,参与调节多种细胞生理活动。为探究Ca²⁺及其相关蛋白在NDV入侵HeLa细胞过程中的作用,本试验使用特异性化学抑制剂/激动剂药物、小干扰RNA、过表达显性负突变体等方法,运用荧光定量PCR、Western blot手段检测NDV感染HeLa细胞后病毒基因组数量、NP蛋白表达量的变化以及相关蛋白的激活情况,结果显示:在NDV入侵He La细胞过程中,提高胞外Ca²⁺浓度能在一定范围内促进病毒进入细胞而去除胞外Ca²⁺则减少病毒进入。使用Ca²⁺螯合剂、Ca²⁺通道或Ca²⁺下游靶蛋白特异性抑制剂/激动剂也会相应减少/促进病毒入胞。该结果表明Ca²⁺参与调节NDV入侵HeLa细胞。TRPC是细胞质膜上一类重要的Ca²⁺通道,荧光定量PCR检测结果表明TRPC4在HeLa细胞上表达量最高。通过转染小干扰RNA、过表达TRPC4野生型以及显性负突变体质粒的方法,发现干扰掉TRPC4后病毒入胞减少,补加入CaCl₂后病毒入胞相应增加。过表达TRPC4野生型后病毒入胞增加,而过表达显性负突变体则入胞减少。综合这些结果表明,TRPC4作为HeLa细胞重要的离子通道介导胞外Ca²⁺进入细胞内从而促进病毒入胞。AnnexinA2（AnxA2）是Ca²⁺的下游靶蛋白之一,主要在胞吞途径的早期阶段起作用。我们通过转染干扰RNA、过表达AnxA2的方法发现,干扰AnxA2抑制病毒入胞而过表达AnxA2促进病毒入胞。但是AnxA2对病毒入胞的促进作用明显强于抑制作用。该结果表明,NDV入侵He La细胞并不完全依赖AnxA2,可能还存在其他入胞途径。脂筏（lipid raft）是细胞质膜中富含胆固醇和鞘磷脂的区域,能作为细胞信号转导的平台,可以聚集受体形成信号转导所需的复合物。脂筏能重排受体（如EGFR）、离子通道以及它们的下游分子来调节胞内信号通路。EGFR、TRPC4以及AnxA2往往定位在脂筏中起作用,因此我们通过免疫共沉淀实验表明了TRPC4与AnxA2存在相互作用。在病毒的入胞过程中,细胞信号转导相伴随发生的。我们检测了NDV入胞过程中EGFR的激活情况并检测了在Ca²⁺通道或Ca²⁺下游靶蛋白特异性抑制剂/激动剂的作用下EGFR的激活情况。结果表明,在NDV入侵He La细胞的过程中EGFR被激活了并且该激活可能是Ca²⁺依赖型的。在病毒入胞过程中,cofilin（CFL）调节肌动蛋白（actin）的活性促使胞吞小体穿过拥挤的细胞质。检测cofilin（CFL）的活性可以了解actin的解聚状态。我们发现CFL的活性具有双向调节性。该结果表明CFL调节actin活性,参与NDV入侵He La细胞。结论:在NDV感染HeLa细胞的过程中,TRPC4作为细胞重要的离子通道介导胞外Ca²⁺进入细胞内。Ca²⁺参与调节EGFR的激活从而促进NDV入胞。