论文部分内容阅读
目的:构建幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Lpp20,并在HeLa细胞中进行表达。通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,观察其所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制高效、新型的幽门螺杆菌核酸疫苗提供实验依据。方法:用PRIMER5.0软件设计引物,PCR扩增Lpp20全基因;将PCR产物纯化后插入pGEX-6P-2载体,将重组质粒pGEX-6P-2/Lpp20转化入表达宿主菌BL21(DE3)进行诱导表达,纯化重组蛋白并分析其免疫反应性。再将Lpp20基因克隆至pcDNA3.1(+)真核细胞表达载体构建pcDNA3.1(+)/Lpp20重组体,并转染HeLa细胞,用免疫细胞化学及Western-blot观察鉴定其在真核细胞得到表达后,将核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Lpp20、对照空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分组通过肌肉注射免疫6w龄C57BL/6小鼠,隔两周免疫一次,共免疫四次。ELISA间接法测定小鼠血清中抗Lpp20 IgG抗体水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应。通过PCR法检测小鼠肌细胞中Lpp20基因的存在。结果:成功克隆了Lpp20基因,并将其成功构建到了pGEX-6P-2原核表达载体上,SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,重组工程菌表达了一相对分子量(Mr)约为44 KDa的目的蛋白条带, Western-blot检测显示重组蛋白有良好的免疫反应性。成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20真核表达载体,且重组质粒能在HeLa细胞内有效表达目的蛋白。小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,6w后ELISA测定血清抗体A450值为0.74,效价为1:1024。核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显升高(410.36±56.23pg/mL),与空质粒组(25.26±10.85pg/mL)之间有显著性差异(P<0.01)。脾淋巴细胞增殖反应测定,核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数(2.37±0.22)明显高于空质粒组(1.53±0.47)和PBS组(1.20±0.13)(P<0.01)。PCR检测Lpp20基因可在小鼠肌细胞中存在。结论:(1)成功克隆了幽门螺杆菌Lpp20基因,并构建了pGEX-6P-2/Lpp20原核表达载体,且其可在原核细胞内表达具有良好免疫反应性的重组蛋白。(2)成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20真核表达载体且其能在真核细胞中表达。(3) pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答。(4) pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗接种C57BL/6小鼠后能在肌细胞中存在。