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椎间盘退变是一系列脊柱退行性疾病的病理基础，通常认为它是一个与年龄相关多因素介导的综合病理过程。目前临床上对其干预手段及疗效都十分有限，近年来通过外源性基因转染椎间盘细胞延缓其退变进程成为一个研究热点,其中SIRT1在一些年龄相关性疾病的研究中展现出了积极的疗效。本项目拟从髓核细胞体外培养生物学特性；白藜芦醇对退变髓核细胞合成胞外基质调控作用研究；SIRT1基因对早期退变椎间盘胞外基质与细胞凋亡调控作用及其机制研究三部分进行阐述。第一部分髓核细胞体外培养生物特性研究目的：对临床椎间盘摘除术来源的髓核组织进行培养鉴定。方法：采用酶序贯消化法对髓核组织进行分离，行单层原代细胞培养。采用大体形态观察，细胞免疫组化法，细胞免疫荧光法，CD24流式细胞检测等方法对髓核细胞进行鉴定。取单层培养的第1、3、5、7代髓核细胞分别行形态学观察，SA-β-gal染色观察细胞衰老及甲苯胺蓝染色观察蛋白多糖表达。取同为第1代细胞分别进行单层培养和藻酸盐立体培养，观察其胞外基质表达和细胞增殖差异。结果：成功分离培养出原代髓核细胞，经大体形态观察，II型胶原和aggrecan细胞免疫荧光，HIF-1α细胞免疫组化及CD24流式细胞检测综合判定所培养的细胞为髓核细胞。形态学观测及SA-β-gal、甲苯胺蓝染色示，在体外连续单层培养条件下髓核细胞容易改变自身表型，发生去分化现象，且随着传代次数的增加趋势愈加明显。藻酸盐培养条件下细胞增殖速率低于单层培养，但胞外基质collagen II和aggrecan表达显著提高。结论：酶序贯消化法可以成功培养出髓核细胞，单层培养过程中容易使髓核细胞失去固有表型，而藻酸微球培养环境有利于髓核细胞在体外培养条件下维持表型，维持胞外基质的表达，为进一步细胞学的检测打下基础。第二部分白藜芦醇对退变髓核细胞合成胞外基质调控作用研究目的：研究SIRT1生物激动剂RES对人退变椎间盘髓核细胞合成ECM的影响。方法：取腰椎间盘突出症患者术中摘除的髓核组织，对其进行分离、体外藻酸盐三维培养，采用不同浓度RES（50μmol/L和10μmol/L）和sirtinol（10μmol/L和1μmol/L）分别刺激，PCR检测对SIRT1、II型胶原、aggrecan的mRNA表达。在10ng/ml IL-1β刺激下检测50μmol/LRES与10μmol/L sirtinol对相关代谢酶MMP-2、13，ADAMTS-5，TIMP-1的mRNA表达影响。结果：白藜芦醇处理后，无论是RT-PCR还是qRT-PCR均显示SIRT1、II型胶原、aggrecan的mRNA表达水平增高，qRT-PCR示RES亦明显抑制了IL-1β所诱导的MMP-2、13，ADAMTS-5的增高，TIMP-1的mRNA表达在与对照组的比较中显著升高，sirtinol组观测结果刚好相反。结论：RES可刺激退变髓核细胞ECM的合成，可以抑制IL-1β介导的对ECM的降解作用，这种调节作用与SIRT1的活性有关。第三部分SIRT1基因对早期退变髓核细胞胞外基质与细胞凋亡调控作用及其机制研究目的：研究SIRT1对早期退变椎间盘髓核细胞ECM和细胞凋亡的调控机制。方法：取腰椎间盘突出症患者手术来源的髓核组织，运用磁共振，免疫组化，TUNEL染色，P53、P21蛋白测定以及甲苯胺蓝染色等方式初步探讨SIRT1与ECM和细胞凋亡之间的关系。对年轻组的髓核细胞行体外藻酸盐三维培养，运用SIRT1-siRNA和慢病毒介导的SIRT1过表达载体转染髓核细胞，靶向调控SIRT1的沉默和过表达，检测其对ECM合成影响，加入10ng/ml IL-1β刺激后，western blot，DMMB法，流式细胞仪检测胞内SIRT1受到靶向调控后对IL-1β诱导的胞外基质降解和细胞凋亡的影响。Western blot检测慢病毒转染后对P65和乙酰化P65蛋白表达的影响，免疫共沉淀检测SIRT1与P65之间是否存在相互作用，细胞免疫荧光观察SIRT1对P65核内迁徙的影响。结果：老年组SIRT1的表达明显低于年轻组，而细胞凋亡率和合成ECM的能力亦明显低于年轻组。SIRT1表达被siRNA靶向沉默后，白藜芦醇对ECM的促进作用明显减弱。慢病毒转染成功后，SIRT1表达增高，酶的活性亦随之增高，但western blot检测COL2A1和aggrecan的蛋白表达并没有明显差异，DMMB法测GAG表达与对照组相比也未见明显差异。但SIRT1过表达后对IL-1β介导的ECM降解以及细胞凋亡具有明显保护作用。SIRT1过表达后可以显著抑制IL-1β诱导的细胞凋亡，SIRT1-siRNA组的细胞凋亡率则明显上升。SIRT1过表达后能降低乙酰化P65蛋白的表达水平，阻止IL-1β介导的P65向核内迁徙，且免疫共沉淀示SIRT1与P65蛋白之间存在相互作用。结论：SIRT1在早期退变的髓核组织中存在着重要的调控作用，有望成为治疗椎间盘退行性疾病的潜在靶点。