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松属(Pinus)树种的短枝着生于长枝上，当长枝截顶处理后，短枝上的腋芽萌发形成新的枝条，而这些新生枝条可以作为扦插、嫁接穗条以及组织扩繁的理想材料。模式植物的研究表明腋芽萌发与植物激素、糖分途径以及转录调控密切相关，但截止目前，松属树种短枝腋芽萌发生长的分子调控机制尚未明晰。本研究以马尾松(Pinus massoniana)为研究对象，结合课题组前期完成的马尾松短枝腋芽转录组测序数据及外部形态特征信息，利用WGCNA方法构建马尾松短枝腋芽萌发生长过程的加权基因共表达网络，重点从植物激素、糖分途径等方面，解析参与调控短枝腋芽萌发生长过程的关键基因，并克隆高度相关模块的枢纽基因进行验证及生物信息学分析，以期为马尾松短枝腋芽萌发生长调控的分子机制提供理论基础。主要研究结果如下：
1.基于马尾松腋芽转录组数据进行植物激素、糖分通路分析发现，有139个转录本注释到IAA信号转导途径，其中AUX1、TIR1、AUX/IAA、ARF、CH3和SAUR主要在截顶后第4d及之后呈上调表达模式，117个转录本注释到IAA生物合成途径，其中CALDH、YUCCA注释最多且在腋芽萌发各时期均有上调表达。CK信号转导途径共注释到85个转录本，注释最多的是B-ARR并在整个腋芽萌发生长过程均有上调表达，生物合成途径注释到37个转录本，CKX、miaA、CYP735A和CISZOG注释最多并在各时期均有上调表达。GA信号转导途径共注释到44个转录本，生物合成途径注释到83个转录本，注释最多的是DELLA、GID2和CPS，且主要在截顶后第4d上调表达。糖分生物合成途径注释到184个转录本，注释最多的是SUS、SPS、TPS和INV，分别有59、37、34和30个，且在腋芽休眠解除萌发生长过程均有上调表达，并主要参与蔗糖、6-磷酸海藻糖、海藻糖和D-葡萄糖等合成过程。
2.通过WGCNA分析，构建了17个共表达基因模块用于下游分析，再利用基因模块与样本及样本特征进行相关性分析，得到与马尾松腋芽萌发生长呈高度相关的darkgrey、darkgreen和grery60三个模块；其中darkgrey和darkgreen模块基因均在截顶后第4d上调表达，表明这两个模块与腋芽休眠解除高度相关。grery60模块基因在截顶后第20d及之后上调表达，而此时腋芽膨大并展开多层鳞叶，纵向开始快速生长，表明该模块基因主要参与腋芽萌发生长成枝条过程的调控。对三个模块基因进行KEGG和GO富集分析发现，这些基因主要与萜类及二萜类、糖分及碳水化合物、氨基酸及转录调控活性等生物合成代谢相关。而转录因子分析结果显示，darkgrey和darkgreen模块中未检测到转录因子，但在grery60模块共检测到78个转录因子分布在18个亚族中，最多的转录因子家族为AP2/ERF-ERF，共20个。进一步筛选三个模块内连通性排名前10的枢纽基因，通过BLAST同源比对鉴定到糖转运基因SWEET、细胞分裂素羟化酶基因CYP735A、赤霉素生物合成途径关键基因CPS、生长素响应因子SAUR、萜类物质合成关键限速酶调节基因IPPI和一个转录因子C2H2/AZF2基因。
3.为验证糖分在马尾松腋芽萌发过程中的功能，选取马尾松糖转运基因PmSWEET进行克隆表达及生物信息学分析。结果表明该基因具有完整CDS序列共687bp，编码228个氨基酸。蛋白结构分析显示PmSWEET含有2个保守结构域(MtN3)和7个跨膜区域，无信号肽结构；蛋白质相对分子质量25244.14Da，理论等电点PI为5.78；亲水性指数(GRAVY)为0.924，属疏水蛋白。与拟南芥SWEET基因家族进行系统进化树分析显示，PmSWEET与拟南芥的AtSWEET16、AtSWEET17和杨树的PtSWEET16、PtSWEET17一起被划分到第4分支，包含保守基序Motif1、2、3、4、5和6；多重序列比对显示PmSWEET与欧洲云杉(MA_1083g0010)、火炬松(PITA_000023426)、杨树(Potri.013G014400)和拟南芥(AT4G15920)的相似性高达80.37%、78.70%、72.69%和53.46%。进一步通过荧光定量PCR对PmSWEET基因在针叶和腋芽中的表达量进行分析，结果显示其在针叶中的表达略高于腋芽，并在针叶中呈“上升-下降”表达趋势，且在截顶后第4d达到最高表达水平，为截顶前(0d)的21.4倍，随后呈下降趋势；而在腋芽中整体呈“上升-下降-上升”表达趋势，并在截顶后第1d达到最高水平，为0d的5倍；表明对长枝进行截顶处理后，PmSWEET基因在针叶和腋芽中高表达，提高了针叶光合作用产生的糖分向腋芽组织的转运，从而促进了短枝腋芽休眠解除及萌发。
1.基于马尾松腋芽转录组数据进行植物激素、糖分通路分析发现，有139个转录本注释到IAA信号转导途径，其中AUX1、TIR1、AUX/IAA、ARF、CH3和SAUR主要在截顶后第4d及之后呈上调表达模式，117个转录本注释到IAA生物合成途径，其中CALDH、YUCCA注释最多且在腋芽萌发各时期均有上调表达。CK信号转导途径共注释到85个转录本，注释最多的是B-ARR并在整个腋芽萌发生长过程均有上调表达，生物合成途径注释到37个转录本，CKX、miaA、CYP735A和CISZOG注释最多并在各时期均有上调表达。GA信号转导途径共注释到44个转录本，生物合成途径注释到83个转录本，注释最多的是DELLA、GID2和CPS，且主要在截顶后第4d上调表达。糖分生物合成途径注释到184个转录本，注释最多的是SUS、SPS、TPS和INV，分别有59、37、34和30个，且在腋芽休眠解除萌发生长过程均有上调表达，并主要参与蔗糖、6-磷酸海藻糖、海藻糖和D-葡萄糖等合成过程。
2.通过WGCNA分析，构建了17个共表达基因模块用于下游分析，再利用基因模块与样本及样本特征进行相关性分析，得到与马尾松腋芽萌发生长呈高度相关的darkgrey、darkgreen和grery60三个模块；其中darkgrey和darkgreen模块基因均在截顶后第4d上调表达，表明这两个模块与腋芽休眠解除高度相关。grery60模块基因在截顶后第20d及之后上调表达，而此时腋芽膨大并展开多层鳞叶，纵向开始快速生长，表明该模块基因主要参与腋芽萌发生长成枝条过程的调控。对三个模块基因进行KEGG和GO富集分析发现，这些基因主要与萜类及二萜类、糖分及碳水化合物、氨基酸及转录调控活性等生物合成代谢相关。而转录因子分析结果显示，darkgrey和darkgreen模块中未检测到转录因子，但在grery60模块共检测到78个转录因子分布在18个亚族中，最多的转录因子家族为AP2/ERF-ERF，共20个。进一步筛选三个模块内连通性排名前10的枢纽基因，通过BLAST同源比对鉴定到糖转运基因SWEET、细胞分裂素羟化酶基因CYP735A、赤霉素生物合成途径关键基因CPS、生长素响应因子SAUR、萜类物质合成关键限速酶调节基因IPPI和一个转录因子C2H2/AZF2基因。
3.为验证糖分在马尾松腋芽萌发过程中的功能，选取马尾松糖转运基因PmSWEET进行克隆表达及生物信息学分析。结果表明该基因具有完整CDS序列共687bp，编码228个氨基酸。蛋白结构分析显示PmSWEET含有2个保守结构域(MtN3)和7个跨膜区域，无信号肽结构；蛋白质相对分子质量25244.14Da，理论等电点PI为5.78；亲水性指数(GRAVY)为0.924，属疏水蛋白。与拟南芥SWEET基因家族进行系统进化树分析显示，PmSWEET与拟南芥的AtSWEET16、AtSWEET17和杨树的PtSWEET16、PtSWEET17一起被划分到第4分支，包含保守基序Motif1、2、3、4、5和6；多重序列比对显示PmSWEET与欧洲云杉(MA_1083g0010)、火炬松(PITA_000023426)、杨树(Potri.013G014400)和拟南芥(AT4G15920)的相似性高达80.37%、78.70%、72.69%和53.46%。进一步通过荧光定量PCR对PmSWEET基因在针叶和腋芽中的表达量进行分析，结果显示其在针叶中的表达略高于腋芽，并在针叶中呈“上升-下降”表达趋势，且在截顶后第4d达到最高表达水平，为截顶前(0d)的21.4倍，随后呈下降趋势；而在腋芽中整体呈“上升-下降-上升”表达趋势，并在截顶后第1d达到最高水平，为0d的5倍；表明对长枝进行截顶处理后，PmSWEET基因在针叶和腋芽中高表达，提高了针叶光合作用产生的糖分向腋芽组织的转运，从而促进了短枝腋芽休眠解除及萌发。