【摘 要】
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鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S.T）是一群非适应性或泛嗜性的沙门氏菌,能引起各种家禽和哺乳动物的传染病,也可引起人类感染,在医学、兽医和公共卫生等方面均具有重要意义。沙门氏菌致病性主要与基因组上成簇分布的编码致病相关基因的特定区域,即毒力岛（SPI）相关,其中SPI-1和SPI-2与致病性密切相关。沙门氏菌利用其毒力岛上的三型分泌系统（T3SS）向宿主细胞内分泌一
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鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S.T）是一群非适应性或泛嗜性的沙门氏菌,能引起各种家禽和哺乳动物的传染病,也可引起人类感染,在医学、兽医和公共卫生等方面均具有重要意义。沙门氏菌致病性主要与基因组上成簇分布的编码致病相关基因的特定区域,即毒力岛（SPI）相关,其中SPI-1和SPI-2与致病性密切相关。沙门氏菌利用其毒力岛上的三型分泌系统（T3SS）向宿主细胞内分泌一些致病因子,SPI-1上T3SS主要在沙门氏菌入侵宿主细胞的过程中起到重要作用,SPI-2上T3SS主要在沙门氏菌入侵宿主细胞后的维持中起到重要作用。hilD基因位于SPI-1上,体外环境下,该基因编码的Hil D蛋白不仅调控SPI-1上基因表达,而且通过与位于SPI-2上的ssr AB基因启动子结合,实现诱导SPI-2上相关毒力基因的表达。体内环境中Hil D对ssr AB基因调控作用的研究尚未见报道。本研究以鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,构建hilD基因缺失株及其回补株,比较hilD基因缺失株及其回补株与亲本株的生物学特性,认识hilD基因功能,为深入研究体内环境下Hil D对SPI-2的调控作用奠定基础。首先,通过Overlap PCR获得S.T的hilD基因缺失片段,构建重组自杀性质粒p WM91-ΔhilD,结合同源重组方法构建缺失株S.T（ΔhilD）;PCR扩增包含hilD基因完整序列的片段948bp,构建重组表达载体pc DNA3.1-hilD,运用电转化构建hilD基因回补株S.T（ΔhilD+pc DNA3.1-hilD）、hilD基因缺失株空质粒菌S.T（ΔhilD+pc DNA3.1）和亲本株空质粒菌S.T（pc DNA3.1）。其次,比较S.T（ΔhilD+pc DNA3.1）与S.T（pc DNA3.1）、S.T（ΔhilD+pc DNA3.1-hilD）的生物学特性:连续培养传30代且PCR检测hilD基因缺失的遗传稳定性;光密度法测定菌株的生长曲线;结晶紫法鉴定菌株的生物膜形成能力;改良寇氏法测定灌胃攻毒及腹腔攻毒对小鼠的致病力;利用He La细胞测定菌株的黏附性和侵袭力。结果显示,成功缺失570bp构建了S.T（ΔhilD）,成功回补包含hilD基因948bp构建了S.T（ΔhilD+pc DNA3.1-hilD）。S.T（ΔhilD+pc DNA3.1）可稳定遗传缺失hilD基因片段,体外生长速率无显著改变（P>0.05）;生物膜形成能力显著高于S.T（pc DNA3.1）及S.T（ΔhilD+pc DNA3.1-hilD）（P<0.05）;对小鼠的致病力明显减弱（P<0.05）,灌胃攻毒LD50为1.8×1012,较S.T（pc DNA3.1）和S.T（ΔhilD+pc DNA3.1-hilD）分别升高了11.9倍和19倍,腹腔攻毒LD50为1.7×10~8,较S.T（pc DNA3.1）和S.T（ΔhilD+pc DNA3.1-hilD）分别升高了5.3倍和4.6倍;黏附力较S.T（pc DNA3.1）和S.T（ΔhilD+pc DNA3.1-hilD）分别降低了8.4倍和7.6倍（P<0.05）,侵袭力较S.T（pc DNA3.1）和S.T（ΔhilD+pc DNA3.1-hilD）分别降低了16.2倍和8.4倍（P<0.05）。结果表明,本研究通过基因工程技术成功构建了鼠伤寒沙门氏菌hilD基因缺失株S.T（ΔhilD）和hilD基因回补株S.T（ΔhilD+pc DNA3.1-hilD）。hilD基因的缺失不影响鼠伤寒沙门氏菌正常生长代谢过程,但会减弱其致病力以及对上皮细胞的黏附力和侵袭力。
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