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研究背景血管瘤是由血管内皮细胞增殖形成的一种肿瘤,75%~80%的血管瘤患者为女性。它被认为是最常见的良性肿瘤,此外,血管瘤患者不需要任何治疗,因为它们多年来自发消退。然而,仍有10%的血管瘤会急剧增长甚至成为生命危险。快速增殖的一个阶段是血管瘤的主要特征,然而,造成这种快速增殖的原因没有得到很好的说明。因此,迫切需要对涉及血管瘤进展的风险因素进行更多研究。邻苯二甲酸酯用于各种食品包装,家用产品,医疗器械,药物配方和工业塑料。世界上每年生产约600万吨邻苯二甲酸酯。人类通过皮肤,吸入和摄入吸收暴露于邻苯二甲酸酯。邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Dioctyl phthalate,DEHP)是邻苯二甲酸酯中使用最多的一种,它可以使医疗器械变得更加灵活。人类可能通过塑料医疗设备暴露于高水平的DEHP。在与血清,血液和其他亲脂性流体接触后,DEHP很容易从塑料中浸出,作为高度疏水的材料。一旦DEHP进入人体后,迅速代谢成其活性代谢产物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)[Mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP],然后被优先吸收。最近,研究表明DEHP和MEHP都可以通过触发细胞增殖,迁移和侵袭来促进肿瘤进展。邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[Di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]是一种广泛使用的增塑剂,可代谢为邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)[Mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]。吸入是两种邻苯二甲酸酯的重要暴露途径,它们对肺部的影响包括炎症,扩大的空域和细胞分化变化,已经表明这表明肺泡上皮细胞是邻苯二甲酸酯的靶标。然而,MEHP在HA进展中的潜在作用和相关机制并未得到很好的说明。DEHP被广泛用于生产聚氯乙烯医疗材料的研究。它可以被代谢成MEHP,已被认为是MEHP对人体毒性最大的代谢产物。最近,研究表明DEHP和MEHP均可促进肿瘤通过触发细胞增殖,迁移和侵袭而进展。MEHP是一种破坏内分泌的化学物质,已广泛用于生产食品和饮料,粘合剂,油漆和牙科密封胶的塑料容器。越来越多的证据表明MEHP对人体健康具有负面影响。MEHP具有出色的稳定性。迄今为止,MEHP已成为世界范围内广泛用于工业产品的产品,包括洗涤剂,酚醛树脂,电镀溶剂和热敏纸。流行病学研究表明,MEHP可以在人的尿液和血液中被广泛检测到。例如,来自美国和亚洲的81%尿液样本中含有可检测的MEHP,这表明MEHP的生物安全性是公共卫生的紧迫问题。越来越多的证据表明,MEHP在体内和体外具有很强的雌激素反应,导致内分泌功能的破坏。新兴的报道表明,MEHP会触发乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵。但是,邻苯二甲酸MEHP对HA进展的潜在影响尚未很好地说明其作用机制,故而成我目前的研究焦点。1、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)促进血管瘤细胞(HA)的体外增殖和迁移的机制目的:探究邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)促进血管瘤细胞的体外增殖和迁移的机制。方法:血管瘤细胞用于我们的实验,将其保存在含有15%胎牛血清和青霉素/链霉素(100μg/ml)的改良的Eagle培养基中。在细胞生长期间每天更换培养基,当细胞达到80-90%汇合时,将细胞悬液以1:3的比例传代培养。根据实验要求将培养细胞分为两组:对照组(正常培养的细胞系作为实验对照),MEHP诱导组(将细胞5 x 10~4细胞/每孔接种到6孔板中。温育8小时后,将细胞用10 nM MEHP处理并培养24小时)。逆转录定量PCR(RT-qPCR)实时分析YAP、IRF-1的mRNA表达情况;蛋白印迹分析细胞中相关蛋白表达情况;划痕侵袭实验检测细胞的迁徙情况;通过凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡和相对活力;MTT实验比较细胞增殖情况;结果:MEHP诱导组较对照组YAP、IRF-1mRNA表达升高(P<0.05)。MEHP可以通过IRF-1增加YAP的转录。对照组较MEHP诱导组E-钙粘着蛋白表达升高(P<0.05),MEHP诱导组较对照组MMP9蛋白表达升高(P<0.05)。说明了MEHP促进细胞上皮间质转化过程。对照组较MEHP诱导组细胞迁移数量减少(P<0.05),MEHP诱导组较对照组细胞侵袭数量增多(P<0.05)。说明MEHP可诱导细胞的迁移侵袭。细胞在培养24小时和72小时根据制造商的规程使用凋亡检测试剂盒进行检测细胞凋亡情况,24小时对照组较MEHP诱导组细胞凋亡率升高(P<0.05),第72小时MEHP诱导组较对照组细胞凋亡率降低(P<0.01)。在不同培养后第10小时,对照组与MEHP诱导组相比细胞增殖力无差异(P>0.05),24小时和36小时时MEHP诱导组较对照组细胞增殖数目升高(P<0.05),到第三天检测时发现对照组较MEHP诱导组较细胞增殖情况降低(P<0.01)。细胞暴露与MEHP情况下增殖能力加强。结论:MEHP可通过上调YAP表达促进HA细胞的增殖,并促进上皮间质转化过程相关的因子E-钙粘着蛋白、MMP9的表达。2、通过抑制YAP阻断MEHP触发的血管瘤细胞(HA)增殖的机制目的:探究通过抑制YAP阻断MEHP触发的HA细胞增殖的机制。方法:HemEC来源为在我院收录诊治的7例HA婴儿患者中分离出来,在应用于实验之前,细胞传代培养不能超过五次。在标准条件下,在补充有10%热灭活的胎牛血清,0.25%真菌区和1%庆大霉素的α-MEM中培养HemEC。根据实验要求,将元代培养的细胞进行培养后不同处理:对照组(取正常原代培养的HemEC细胞用于培养计数、观察),MEHP处理组(对照组细胞在刚开始培养时给予一定浓度的MEHP诱导处理,然后继续培养),YAP沉默组(用针对YAP的siRNA转染细胞,抑制YAP的表达)。通过MTT细胞增殖检测测定不同时间段MEHP干预及YAP表达受限对细胞的影响情况;细胞凋亡检测试剂盒和2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基检测各组细胞凋亡及活力情况;通过细胞划痕平面迁移实验检测细胞的迁移活性。蛋白印迹分、RNA提取和半定量RNA分析、酶联免疫吸附实验检测各组细胞中YAP、CTGF、ANKRD1表达情况。结果:在第12小时MEHP干预组较YAP沉默组细胞增殖升高(P<0.05),对照组与MEHP干预组比较无差异(P>0.05)。第24小时对照组和MEHP干预组较YAP沉默组细胞增殖升高(P<0.05)。72小时MEHP干预组较对照组、YAP沉默组细胞增殖情况升高(P<0.05),YAP沉默组较对照组细胞增殖降低(P<0.05)。细胞经过MEHP处理后诱导其增殖,而YAP表达受到抑制后其细胞的增殖能力下降。MEHP干预组较对照组和YAP沉默组细胞凋亡降低(P<0.05),MEHP干预组较YAP沉默组细胞凋亡(P<0.01),说明MEHP抑制细胞凋亡或者YAP表达降低促进了细胞凋亡。对照组和YAP沉默组较MEHP干预组细胞活力降低(P<0.05),其中MEHP干预组较YAP沉默组细胞活力升高(P<0.01)。MEHP干预组较对照组和YAP沉默组细胞迁移升高(P<0.05),YAP沉默组较对照组细胞迁移数量降低(P<0.05)。YAP沉默组较MEHP干预组细胞迁移数量降低(P<0.01)。MEHP干预组较对照组YAP、CTGF、ANKRD1蛋白表达升高(P<0.05),YAP沉默组较对照组YAP、CTGF、ANKRD1蛋白表达降低(P<0.05)。MEHP干预组较对照组和YAP沉默组YAP、CTGF、ANKRD1mRNA表达升高(P<0.05),对照组较YAP沉默组YAP、CTGF、ANKRD1mRNA表达升高(P<0.05)。说明YAP表达抑制后,其靶基因CTGF、ANKRD1的表达也受到了抑制。MEHP干预组较对照组和YAP沉默组中YAP、CTGF、ANKRD1水平含量升高(P<0.05),对照组较YAP沉默组YAP、CTGF、ANKRD1水平含量升高(P<0.05)。结论:MEHP可通过上调YAP的表达促进HA细胞的增殖和迁移,YAP可作为血管瘤治疗的潜在靶点。3、MEHP通过降低HA细胞中LATS1(Ser909)的磷酸化水平调节HA细胞的活化和功能的机制目的:本研究旨在探讨MEHP通过降低HA细胞中LATS1(Ser909)的磷酸化水平调节HA细胞的活化和功能的机制。方法:2017年1月至2019年5月在我院被确诊为HA的组织样本和正常皮肤组织。从3例婴儿的增殖期血管瘤中分离出的内皮细胞(HemEC)用于本次实验。根据实验要求,将HA患者肿瘤样本及正常健康皮肤组织样本分成HA组和健康组,用于相关的指标分析研究。将培养的血管瘤细胞分为对照组(常规培养肿瘤细胞系,没有进行处理)和MEHP处理组(对照组肿瘤细胞培养的基础上用一定浓度的MEHP诱导处理细胞12小时)。维替泊芬+MEHP处理组(MEHP处理组的基础上使用是YAP–TEAD的抑制剂维替泊芬),用于探讨MEHP诱导后对HemECs增殖影响。RT-qPCR实时分析两组细胞中LATS1(Ser909)、LATS2(Ser872)的mRNA表达情况;MTT测定不同时期的HemECs增殖情况;蛋白质印迹分析两组细胞中PCNA的表达情况;流式细胞术检测ROS。结果:RT-qPCR实时分析两组细胞中LATS1(Ser909)、LATS2(Ser872)的mRNA表达情况,MEHP处理组较对照组LATS1(Ser909)、LATS2(Ser872)的mRNA表达降低(P<0.05),表明,MEHP处理可以降低LATS1/2(Ser909/Ser872)的磷酸化。不同时间内通过MTT测定两组细胞的增殖情况,第1小时对照组与MEHP处理组比较无差异(P>0.05),第12小时、36小时MEHP处理组较对照组细胞增殖能力升高(P<0.05),第72小时MEHP组较对照组胞增殖能力升高(P<0.01)。YAP是Hippo通路最重要的转导子,可以调节器官大小和肿瘤发生,蛋白印迹检测YAP在健康和肿瘤组中的表达情况,发现HA组较健康组YAP的蛋白表达升高(P<0.05)。蛋白质印迹分析两组细胞中PCNA的表达情况,MEHP处理组较对照组PCNA表达升高(P<0.05),流式细胞术检测ROS,对照组较MEHP处理组ROS含量升高(P<0.05)。结论:MEHP可增加HA细胞的增殖与活力。