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自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK cells),作为与T细胞、B细胞并列的一大类淋巴细胞群体,是天然免疫系统的重要成员。NK细胞除了参与先天性免疫应答之外,还在适应性免疫的免疫调节中起着重要的调控作用。研究表明,NK细胞在病原微生物感染、肿瘤以及自身免疫病等多种病理过程中都发挥着重要的功能。然而,NK细胞的发育、分化以及功能的调节等研究领域还存在许多空白。因此,深入研究NK细胞发育及其功能的调控机制将具有重要的意义。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1),其生物学功能非常广泛,已经有文献报道IGF-1可以促进T、B细胞的发育和生物学功能；但IGF-1在NK细胞发育及功能中有何作用却鲜有报道。本课题主要研究IGF-1在人NK细胞发育及功能中的调控作用,并深入探讨其机制,进一步完善人NK细胞的基础生物学理论,并为NK细胞的临床生物治疗提供坚实的实验基础。本课题首先分离正常的新生儿脐带血来源的CD34+造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC),加入干细胞因子(stem cell factor, SCF)、F1t3配体(fins-like tyrosine kinase-3ligand, Flt3L)和白介素-15(interleukin-15,IL-15)进行长期培养(28天),进行体外NK细胞的分化及扩增,通过在该体系中加入IGF-1,探讨IGF-1对人NK细胞的发育及功能的影响及相关分子机制；其次分离正常人早孕蜕膜NK细胞,体外用IGF-1刺激,进一步阐明IGF-1对人NK细胞功能的影响及分子机制；此外,我们在实验中发现不同来源的NK细胞分泌不同水平的IGF-1,因此,利用IGF-1siRNA及中和抗体阻断实验阐明内源性IGF-1对NK细胞功能的影响；为了揭示不同来源NK细胞差异表达内源性IGF-1的分子机制,我们利用microRNA芯片技术比较不同来源的NK细胞microRNA表达谱差异,以筛选调控NK细胞内源性IGF-1表达的microRNA,并验证目的microRNA通过靶向IGF-1调控NK细胞的功能。一、IGF-1促进人NK细胞发育。我们应用体外人NK细胞诱导分化体系,即体外分离纯化新生儿脐带血来源的CD34+造血干细胞,采用SCF、F1t3L、IL-15联合细胞因子刺激CD34+HSC分化发育为NK细胞。通过在该体系中加入IGF-1,培养28天后收集细胞,计数,进一步采用流式细胞术检测CD3-CD56+NK细胞的比例、表面受体分子的表达及其功能性指标的表达变化,明确IGF-1在人NK细胞的发育及功能中的作用；通过检测NK细胞发育过程中IRS-1的表达水平,初步阐明IGF-1促进NK细胞发育的机制。结果显示,当在该体系中加入IGF-1后,NK细胞的比例和绝对数都有显著提高；流式细胞术检测结果发现加入IGF-1组发育分化的NK细胞杀伤相关分子如穿孔素的表达上调,脱颗粒的能力上调(CD107a表达上调)。此外,我们发现在体外NK细胞发育过程的第14天,即NK细胞前体出现的时间,细胞不表达IRS-1,而在发育过程的第21天,细胞则表达IRS-1。鉴于IRS-1在IGF-1信号传递中的作用,我们得出以下结论：在IGF-1促进NK细胞发育的过程中,IGF-1可能起双重作用,即IGF-1先促进NK细胞前体的分化,之后则促进分化后NK细胞的增殖。综上结果,我们得出如下结论：IGF-1可以促进人NK细胞发育,且有可能提高NK细胞的杀伤潜能。二、IGF-1促进入NK细胞杀伤功能。为了进一步验证IGF-1对人NK细胞杀伤功能的影响,我们首先收集正常人早孕蜕膜组织,分离纯化蜕膜NK细胞,体外用IGF-1刺激培养24h,通过流式细胞术检测NK细胞穿孔素perforin及CD107a的表达；51Cr释放实验检测NK细胞的细胞毒活性(杀伤功能)的变化。同时,我们对IGF-1刺激NK细胞后胞内信号分子进行了初步检测,以进一步阐明IGF-1促进人NK细胞杀伤功能的相关分子机制。流式细胞术检测结果显示,当IGF-1刺激早孕蜕膜NK细胞后,NK细胞perform及CD107a表达均显著上调,51Cr释放实验结果显示,IGF-1刺激蜕膜NK细胞后其细胞毒活性(杀伤功能)也有显著提高。此外,我们发现IGF-1可以促进NK细胞中STAT3的磷酸化,而且STAT3的抑制剂在抑制STAT3活化的同时,也抑制了NK细胞perforin的表达,这表明IGF-1促进NK细胞杀伤功能的机制,可能是通过STAT3信号途径启动了perforin的表达,进而发挥其更强的细胞毒活性。根据这部分结果我们得出如下结论：IGF-1可以促进人NK细胞的杀伤功能。三、内源性IGF-1对NK细胞的杀伤功能至关重要。在实验过程中,我们发现不同来源的NK细胞,如正常人外周血NK (pNK)细胞及早孕蜕膜组织中的NK (dNK)细胞均可分泌IGF-1,且分泌水平存在差异。鉴于不同来源的NK细胞其杀伤功能存在差异,因此我们推测内源性IGF-1可能参与NK细胞杀伤功能的调控。为了进一步验证内源性IGF-1在人NK细胞杀伤功能中的重要调控作用,我们利用核转染技术将IGF-1siRNA转染NK细胞系,qRT-PCR检测perforin等杀伤相关基因的表达变化；利用IGF-1中和抗体处理人外周血NK细胞,51Cr释放实验检测NK细胞杀伤功能的变化。结果显示,当IGF-1siRNA转染NK细胞系后,NK细胞perforin表达下调；51Cr释放实验结果显示：当IGF-1中和抗体处理外周血NK细胞后,NK细胞的杀伤功能显著降低。此外,我们发现临床上反复流产病人的早孕蜕膜NK(dNK)细胞较正常人早孕蜕膜NK (dNK)细胞表达较高的内源性IGF-1,这与它们的杀伤能力呈正相关趋势。综上结果我们得出如下结论：内源性IGF-1对NK细胞的杀伤功能至关重要。四、miR-483-3p靶向IGF-1调控人NK细胞的杀伤功能。为了揭示不同来源NK细胞差异表达内源性IGF-1的分子机制,我们采用microRNA芯片技术,比较不同来源的NK细胞(dNK, cNK, pNK)以及外周血来源的NKT和T细胞之间microRNA的表达谱差异；利用靶基因预测网站分析与IGF-1相互作用的microRNA;利用分子克隆方法构建IGF-13’UTR双荧光素酶报告载体并鉴定,之后进行双荧光素酶报告基因检测方法验证microRNA与靶基因相互作用；利用microRNA模拟体mimic和抑制剂inhibitor,并结合IGF-1中和抗体阐明microRNA通过靶向IGF-1调控人NK细胞的杀伤功能。microRNA芯片检测结果显示,不同来源的人NK细胞其microRNA表达谱有着显著的差异；此外我们筛选到7个在NK细胞中特异表达的microRNAs:miR-340*,miR-483-3p, miR-130a, miR-199b-5p, miR-199a-3p,miR-210和miR-362-5p。其中miR-483-3p在早孕蜕膜NK(decidual NK,dNK)细胞中特异性高表达,利用Targetscan等预测网站分析发现IGF-1为其潜在相互作用的靶基因；接下来,我们成功构建了分别包含IGF-1野生型3’UTR及突变型3’UTR的双荧光素酶报告基因载体,并采用双荧光素酶报告基因实验,验证miR-483-3p可与预测靶基因IGF-1相互作用。我们进一步采用miR-483-3p mimic核转染NK细胞,上调NK细胞中miR-483-3p的表达,结果发现NK细胞杀伤能力减弱；相反,用miR-483-3p inhibitor核转染dNK细胞,下调dNK细胞中hsa-miR-483-3p的表达后,结果发现dNK细胞杀伤能力显著增强,并且IGF-1中和抗体可以逆转miR-483-3p inhibitor对NK杀伤功能的影响。这表明miR-483-3p通过直接靶向NK细胞内源性IGF-1的表达,进而抑制NK细胞的杀伤功能。综合以上,本课题的研究发现了生长因子IGF-1在人NK细胞中的新功能,即IGF-1可以促进人NK细胞的发育和细胞毒活性(杀伤功能),并深入阐述了其中的详细机制。此外,我们发现NK细胞的内源性IGF-1的表达对NK细胞的杀伤功能至关重要；不同来源的NK细胞杀伤功能的差异可能来自于其内源性IGF-1的差异表达,NK细胞IGF-1的差异表达受miR-483-3p的调控,即miR-483-3p可以通过靶向IGF-1调控NK细胞的杀伤功能。本研究不仅为NK细胞发育及功能的调控提供了新的机制,还将对人NK细胞的临床生物治疗有着重要意义。