胃癌在全世界范围内是第二常见的恶性肿瘤。它的发病率和死亡率在许多国家都非常高，例如日本、中国、南美、葡萄牙和意大利。而在国内我省(浙江省)的胃癌发病率和死亡率也都高于全国的平均水平。这种胃癌的不同地理分布可能与患者不同的遗传基础和生活环境有关。 现已公认。肿瘤的发生发展是多基因积累和多步骤发展的过程。多年来对胃癌的研究表明，多基因积累包括了K-ras突变、c-erbB2扩增等癌基因的激活；APC、TP53突变等抑癌基因的失活以及染色体的杂合性缺失、基因的不稳定、端粒酶的激活、CpG岛的甲基化、细胞周期的异常等等。多步骤发展包括了癌前病变、早期胃癌、进展期胃癌(浸润和转移)等阶段。 然而，现有的研究中存在许多结果不一致，甚至是相互矛盾的地方。可能与胃癌的发病机理在不同人种、不同地域之间存在不一致；各实验小组所采用的实验材料、方法、指标不同等原因有关。尤其在实验的材料模板上，多以肿瘤的组织块为主，组织块中肿瘤成分的多少是直接影响实验结果的重要因素。同时在多步骤的研究中，主要集中在处在各不同阶段病例的肿瘤原发灶的研究，而对原发灶肿瘤向外浸润、转移过程中的分子变化研究甚少。 为此，我们应用激光显微切割系统，通过建立的石蜡切片LMD-PCR和IHC-LMD-PCR技术，分别切割和收集各种胃腺癌的原发灶、脉管内瘤栓和／或淋巴结转移灶和／或远处脏器转移灶和／或播散灶等。观察在胃癌演进过程中起重要作用的两个分子事件，微卫星不稳定和TP53基因突变的改变。通过分析微卫星不稳定和TP53基因突变，以及TP53基因突变与TP53蛋白表达的关系，进一步阐明微卫星不稳定和TP53基因突变在胃腺癌浸润转移过程中的变化以及发挥的重要作用，并为今后胃腺癌分子病理学诊断的开展提供重要的实验基础。 第一部分：建立石蜡切片LMD-PCR技术 为了能对存档蜡块进行回顾性的分子生物学研究，我们从以下六个方面建立和完善了石蜡切片的激光显微切割-PCR技术平台。①建立稳定的石蜡切片LMD-PCR技术：分别用直接进浙江大学博士学位论文行PCR方法、酚一氯仿抽提DNA一PCR方法、WGA一PCR方法、粗提DNA一PCR方法提取经激光显微切割的3例胃癌石蜡切片标本DNA，并且每种方法切割的细胞数均相同，通过进行p一globin的PcR，观察是否有成功扩增的目的片段，以比较这4种方法的优缺点，寻找一种最稳定有效的LMD一PCR技术以满足后续实验的要求。②蜡块存档时间对LMD一PCR技术的影响:分别用LMD切割1 986一1 991年间存档10年以上的组织石蜡切片(每年5例进展期胃腺癌)，进行PCR扩增，以确定可获得DNA满意扩增的存档蜡块的时间年限。③目的片段长度对LMD一PcR技术的影响:分别对LMD切割后的6例进展期胃癌粗提DNA标本进行110bp、268bP、536bp、989bp、1 327bp片段长度的扩增，以观察此类标本可扩增片段的最长长度。④显微切割细胞数对LMD一CR技术的影响:用LMD分别从3例胃旁正常淋巴结中切割5、10、50、100和500个细胞，进行相同片段长度的PCR扩增，以确定需要满意扩增的最小细胞数。⑤不同核染色对LMD一PCR技术的影响:分别用0.1%甲基绿、核快红、0.04%美蓝、0.06%甲苯胺蓝0、姬姆萨染液、伍U苏木素和Harris苏木素染液对8例进展期胃癌的石蜡切片进行染色，LMD切割相同区域细胞后行荧光定量PCR，比较这7种染色剂的显微镜下观察效果和对LNID一CR技术的影响，从而寻找一种既具有显微镜下组织形态良好辨别，又对LMD一PCR技术的干扰最小的染色方法。⑥不同免疫组化方法对LMD一PCR技术的影响:分别用AP一Fast red系统和H即一DAB系统对8例TP53蛋白表达阳性的进展期胃癌石蜡切片进行TP53单克隆抗体(D压7)的标记，并切割仰53阳性的相同细胞区域，进行荧光定量PCR扩增。比较这2种方法对LMD一CR技术的影响，同时检测了使用热抗原修复方法对LMD一CR的影响，寻找对LMD一PCR技术干扰最小的IHC技术。 结果显示:①粗提DNA方法为LMD一PCR技术首选的DNA提取方法，方法简便，不易污染。②扩增1 38饰的DNA片段，蜡块存档时间应少于巧年，扩增270bp的DNA片段，蜡块存档时间应少于13年。③要得到满意扩增，目的片段长度宜小于536bp。④要取得稳定满意地扩增，提取DNA模板需要5于100个以上的细胞数。⑤甲基绿染色是石蜡切片LMO一PCR技术首选的细胞核染色。@AP一 Fast red显色系统较宜于石蜡切片IHC一LMD一PCR技术，热抗原修复可得到满意的PCR扩增。第二部分:胃腺癌演进过程中微卫星不稳定分析 采用第一部分建立的石蜡切片LMD~PCR技术，对92例胃腺癌的原发灶、脉管内瘤栓、淋巴结转移灶、远处脏器转移及远处播散灶进行了6个微卫星位点(BAT25、BAT26、025123、D55346、D17s250、TP53)的PCR-SSLP一银染的检测，以较全面系统地观察分析发生MSI一H和MSI一的原发性胃腺癌患者的临床病理学特征，并分析青年人胃癌、同时多原发性胃癌、有胃癌家族史的胃腺癌和有组织学异质性的胃腺癌与Msl+之间的相关性，重点研究胃腺癌浸润转移过程中的MS变化以及变化特点。浙江大学博士学位论文