研究背景膀胱癌是常见的肿瘤‘并呈逐年上升的趋势存活率不高,因此对这类病人,临床上迫切需要新的治疗手段。膀胱癌虽然不是传统意义上的内分泌依赖性肿瘤,但近年来的研究结果发现,膀胱癌的发病与进展与多种类固醇激素及其受体密切相关。有研究指出,长期使用糖皮质激素可引起膀胱癌发病率升高,但给出的解释是糖皮质激素导致的免疫抑制[14]。对于糖皮质激素是否直接通过其受体通路影响膀胱癌的发病与进展,目前仍无相关的系统性研究。糖皮质激素(GC)是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类类固醇激素,受促肾上腺皮质激素调节,对细胞的一系列生物学过程,如增殖、分化、凋亡等,都有重要的调节作用,其生物学效应需通过其受体(GR)介导。近年有关糖皮质激素受体(GR)与多种血液系统及实体肿瘤的发生、发展的相关研究以及应用主要集中在以下几个方面：1,GR可有效的诱导白血病细胞凋亡,目前是急性淋巴细胞白血病的化疗基本用药。而一旦肿瘤细胞的GR发生变异,常常就意味着化疗失败,预后不良；2,体外研究证实在骨肉瘤中,GC与其受体作用可抑制骨肉瘤细胞增殖,诱导凋亡,增强细胞间相互粘附；3,小细胞肺癌中GR过表达可以导致肿瘤生长缓慢,细胞凋亡增加,而GR失表达可令肿瘤细胞逃避糖皮质激素引起的凋亡反应；4,在前列腺癌中,糖皮质作用可导致肿瘤细胞凋亡增加、细胞周期停滞、增殖减缓。在体内试验中GC可通过GR抑制前列腺癌新生血管和淋巴管的形成,GR可促进肿瘤细胞凋亡；有充分的数据说明糖皮质激素受体通路活跃程度与多种肿瘤预后有关,但膀胱癌与糖皮质激素受体的相关性,仍是一个新的领域,我们拟对此展开初步研究。研究目标从分子、细胞和临床层面上探讨糖皮质激素及其受体在膀胱癌增殖与转移中可能的作用及其伴行机制,为膀胱癌治疗探索新的思路。1第一部分GR在膀胱癌中的表达、生物学活性鉴定及临床病理联系1.1研究内容通过对临床标本与已有膀胱癌细胞株的检测,了解膀胱癌中GR的表达及其与肿瘤分级、分期、转移、预后的相关性。1.2实验方法1.2.1人膀胱癌组织中GR表达及临床病理关系组织检测：在组织芯片中对膀胱癌癌组织,癌旁组织、转移淋巴结行免疫组织化学染色,分析上述组织中GR,表达的阳性率、阳性强度的差异,探讨GR变化与膀胱癌TNM分期、分级、术后复发、淋巴结转移、及预后的关系。1.2.2GR高表达膀胱癌细胞株的筛选与稳定GR knock-down细胞株的建立1)膀胱癌细胞株中GR的表达：4株膀胱癌细胞株5637, J82, TCC-SUP和UMUC3应用逆转录PCR (Reverse Transcription PCR, RT-PCR)和western blot在mRNA和蛋白两个层面检测GR的表达。2)膀胱癌细胞株中GR的功能：共转染MMTV-luc报告质粒和PRL-TK-luc内对照质粒入待检细胞株,荧光素酶分析(luciferase assay)评价各细胞株中GR功能。3)嘌呤霉素(Puromicin)筛选,建立高活性稳定表达GR-shRNA细胞株,用RT-PCR, Western blot确认表达,细胞常规培养,传代备用。1.3实验结果1.3.1所检测膀胱癌细胞株、组织芯片中膀胱癌、正常尿路上皮、淋巴结转移癌均100%表达GR在4株膀胱癌细胞株UMUC3、TCC-SUP、J82、5637中,RT-PCR和Western-blotting检测了GR均为阳性。在膀胱组织芯片中,所有的正常膀胱尿路上皮、尿路上皮癌、淋巴结转移癌均100%表达GR。1.3.2GR在4株膀胱癌细胞株中均有生理学活性荧光素酶分析法检测了各不同细胞株中GR的生物学活性,地塞米松作用后,细胞中荧光素酶活性的增长倍数依次为UMUC3(23.6倍),TCC-SUP(14.9倍),5637(3.1倍),J82(1.4倍)。糖皮质激素受体拮抗剂RU-486对地塞米松(Dexamethasone, DXM)引起的GR活性激发有很好的拮抗作用。1.3.3成功建立了GR基因沉默的稳定细胞株对建立的稳定GR knock-down细胞株进行了GR表达与转录活性两方面的检测,发现：(1)GR-shRNA稳定感染后UMUC-3-GR-shRNA(U-sh)和TCC-SUP-GR-shRNA(T-sh)中的GR表达均较其父系细胞株UMUC-3-control(U-C)和TCC-SUP-control(T-C)显著下降；(2)UMUC-3-GR-shRNA(U-sh)和TCC-SUP-GR-shRNA (T-sh)中的GR转录活性显著下降。1.4小结(1)正常膀胱尿路上皮、尿路上皮癌、淋巴结转移癌均100%表达GR。(2)糖皮质激素受体拮抗剂RU-486对DXM(地塞米松)引起的GR活性激发有很好的拮抗作用。(3)稳定GR knock-down的细胞株,其GR表达较其父系细胞株UMUC-3-control (U-C)和T-CC-SUP-control(T-C)显著下降；而转录活性也较UMUC-3-GR-shRNA(U-sh)和TCC-SUP-GR-shRNA (T-sh)中的GR转录活性显著下降。2第二部分GC/GR通路对膀胱癌增殖及侵袭能力的影响及机制——体外实验2.1研究内容利用短发卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)基因封闭技术研究GR低表达膀胱癌细胞株与其父系GR高表达膀胱癌细胞株之间体外培养条件下生长、侵袭能力的变化与分子机制以及对GC与GR拮抗剂的不同反应。2.2实验方法2.2.1GR对膀胱癌细胞增殖、分化、侵袭与转移能力的影响1)细胞增殖,凋亡与细胞周期：MTT assay分析细胞增殖,TUNEL assay分析凋亡,流式细胞术分析细胞周期；结合定量PCR(Quantitive PCR, q-PCR)和western-blot分析cycline D1/D2/D3,细胞周期素依赖激酶(Cycline Dependent Kinase, CDK) CDK2/CDK4/CDK6, P21/P27等细胞周期调节分子,Caspase3等凋亡调节分子的表达。2)肿瘤细胞侵袭能力：Transwell小室模型评价肿瘤细胞侵袭能力,明胶酶谱(Gel Zymography)检测基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase, MMP) MMP2/MMP9活性变化；结合q-PCR和western-blot分析MMP2/MMP9、白介素(Interleukin, IL) IL-6、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)等关键蛋白的表达。3)上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)分析：显徽镜下观察体外培养条件下DXM和RU486对膀胱癌细胞形态的影响,应用Image-J软件对细胞形态进行分析(面积、周长、圆度),判断肿瘤细胞的上皮样/间质样形态倾向性；q-PCR或western-blot分析E-Cadherin、 N-Cadherin、β-Catenin、Vimentin、Snail等关键分子的表达。2.2.2GR对NFkB信号通路的调控功能1)GR对NFkB信号通路关键分子表达的影响：Western-blot检测原始膀胱癌细胞株与GR knock-down细胞株中地塞米松(Dexamethasone, DXM)和GR拮抗剂RU486对NFkB主要成员Rel A和其主要抑制蛋白IkB a表达的影响。2)GR对NFkB信号分子入核的影响：免疫荧光方法分别标记GR、Rel A蛋白,观察DXM及RU486作用对GR和Rel A核内转位的影响；分别提取核、浆蛋白,评价DXM、RU486作用对GR、Rel A蛋白核浆分布比例的影响。3)免疫共沉淀分析GR与Rel A是否直接结合,分析不同DXM/RU486作用条件下Rel A与IkB α结合情况,评价GR通路对NFkB通路活化/抑制情况的影响。2.3实验结果2.3.1GC/GR通路激活在体外诱导膀胱癌细胞周期停滞、同时抑制凋亡DXM导致膀胱癌细胞株细胞周期G1停滞,同时抑制凋亡。DXM作用后CDK抑制因子P27/P21呈浓度依赖性上升；凋亡效应分子cleaved caspase-3表达下降；RU-486拮抗DXM作用；在表达GR-shRNA的细胞株中,DXM作用明显减弱。2.3.2GC/GR通路激活抑制膀胱癌细胞侵袭能力Transwell侵袭实验发现在UMUC-3和TCC-SUP细胞株中,DXM显著降低细胞侵袭能力。DXM可以在UMUC3/TCC-SUP细胞株降低MMP-2、MMP-9、IL-6和VEGF的mRNA表达丰度。明胶酶谱分析结果,DXM降低膀胱癌细胞中MMP-2/MMP-9活性。RU-486和GR-shRNA拮抗DXM的作用。2.3.3DXM导致膀胱癌细胞间质-上皮转化DXM作用后,肿瘤细胞表面积、周长、圆度、似圆率均显著增加；Western-blotting实验,DXM作用后,膀胱癌细胞的上皮方向分化的蛋白分子标记物表达上升,间质标记物下降,与形态学变化相符。RU-486和GR-shRNA拮抗DXM的作用。2.3.4DXM对NFkB通路的影响DXM对NFkB本身表达无影响,但明显上调NFkB的主要拮抗蛋白IkBa的表达水平；DXM显著上调NFkB和IkBa免疫共沉淀；胞内NFkB的定位研究,DXM可以导致细胞内NFkB出核。RU-486和GR-shRNA明显减弱上述效应。2.4小结(1) GC/GR通路激活在体外诱导膀胱癌细胞周期停滞、同时抑制凋亡；(2) Transwell侵袭实验发现,DXM显著降低细胞侵袭能力；(3) Western-blotting实验,显示DXM作用后可使膀胱癌细胞的上皮方向分化的蛋白分子标记物表达上升,间质标记物下降,引致肿瘤细胞表面积、周长、圆度、似圆率均显著增加；(4)DXM可明显上调NFkB的主要拮抗蛋白IkBa的表达水平；显著上调NFkB和IKBa的免疫共沉淀；并可导致细胞内NFkB出核。RU-486和GR-shRNA明显减弱上述效应。上述研究结果表明：膀胱癌中GC/GR通路激活可诱导细胞周期停滞,抑制凋亡；并明显抑制侵袭与转移。但未能抑制细胞的增殖,其原因和机制有待进一步探讨。3第三部分GC/GR通路对膀胱癌肿瘤生物学行为影响动物实验3.1研究内容构建严重联合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠皮下荷瘤模型,观察不同克隆细胞、不同药物作用情况下的成瘤和侵袭、转移情况,探讨GR/GC信号通路与膀胱癌生物学行为的关系。3.2实验方法SCID小鼠荷瘤模型的建立与体内实验1)在SCID小鼠皮下注射对照膀胱癌细胞株或GR knock-down细胞株1×106/位点。营造荷瘤小鼠模型成功后,待所有肿瘤体积达到40mm3,实验组皮下埋植DXM缓释药丸(0.5mg DXM/90天),对照组植入空白药丸,观察其对肿瘤生长的影响。2)最大肿瘤达到荷瘤小鼠体重1/10为实验终点,观察肿瘤局部浸润、腹水产生、腹腔转移瘤形成情况,常规苏木素-伊红染色确定。取肿瘤组织免疫组织化学方法检测Ki67表达,评价肿瘤增殖指数；TUNEL法检测凋亡,评织化学方法检测Ki67表达,评价肿瘤增殖指数；TUNEL法检测凋亡,评价DXM对凋亡影响；CD34标记血管内皮细胞,行微血管密度(Microvessel Density, MVD)记数,结合VEGF标记,评价新生血管形成能力。3.3实验结果3.3.1SCID荷瘤小鼠模型中GC/GR通路上调对膀胱癌生长的影响经DXM治疗的UMUC-3-control组平均肿瘤体积较其它三组稍有增大,但无统计学差异；无药物作用的UMUC-3-shRNA组略低于无药物作用的UMUC-3-control组,DXM治疗的UMUC-3-shRNA略高于无药物作用的UMUC-3-shRNA组,均无统计学差异。3.3.2SCID荷瘤小鼠模型中GC/GR通路上调对膀胱癌的侵袭与转移影响无药物作用的小鼠中,7例(88%)发现血性腹水,4例(50%)发现腹腔转移瘤,DXM治疗小鼠中,无一例有血性腹水或腹腔转移瘤发生；DXM治疗的UMUC-3-control组肿瘤中未发现肿瘤对周边骨骼肌的浸润,其它3组均有不同程度的肿瘤周边肌肉侵犯。3.3.3SCID荷瘤小鼠模型中肿瘤的分子免疫学改变DXM治疗的UMUC-3-control组肿瘤Ki-67略高于其它3组,凋亡(TUNEL)低于其它三组,肿瘤侵袭与血管生成相关分子表达(MMP-9/VEGF/CD34)低于其它3组。3.4小结(1)经DXM治疗的荷瘤小鼠模型平均肿瘤体积较其它三组稍有增大,但无统计学差异；(2)经DXM治疗小鼠中,无一例有血性腹水或腹腔转移瘤发生；也未发现肿瘤对周边骨骼肌的浸润,而无药物作用的小鼠中,7例(88%)发现血性腹水,4例(50%)发现腹腔转移瘤,并均有不同程度的肿瘤周边肌肉侵犯。(3)DXM治疗可降低肿瘤侵袭与血管生成相关分子表达。研究结论1)GR在膀胱癌有100%表达,GR高表达可能提示肿瘤预后良好；2) GC/GR通路激活诱导膀胱癌细胞周期停滞,同时抑制凋亡；3) GC/GR通路激活明显抑制膀胱癌侵袭与转移,NFkB细胞通路活性下调是其可能机制。4)膀胱癌中GC/GR通路激活可诱导细胞周期停滞,抑制凋亡；并明显抑制侵袭与转移。但未能抑制细胞的增殖,其原因和机别有待进一步探讨。