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背景:过量或长期紫外线(ultraviolet,UV)辐射将引起皮肤光损伤,其中氧化应激(oxidative stress,OS)在皮肤光损伤的发生发展中有重要作用。研究发现许多干细胞具有对抗OS的作用,而来源于毛囊Bulge区的真皮干细胞即皮肤源性前体细胞(skin-derived precursor cells,SKPs)在抗氧化领域占据重要地位。目的:通过构建三维人工皮肤光损伤模型,移植SKPs至光损伤模型,应用组织学和分子学方法观察光损伤模型移植前后细胞的变化、SKPs抗光损伤细胞凋亡及OS相关指标的表达情况,以探讨SKPs抗光损伤的作用及机制,为进一步体内研究SKPs治疗皮肤光损伤提供实验依据。方法:1.分离新生Balb/c小鼠真皮,于体外悬浮培养SKPs;同时分离2-12岁男童的包皮表皮和真皮,常规培养角质形成细胞(Keratinocytes,KC)和成纤维细胞(Fibroblasts,FBs)。2.采用免疫组织化学法鉴定KC和FBs(实验组前期已成功鉴定SKPs)。3.以鼠尾胶原为支架,接种KC和FBs于体外构建的三维人工皮肤模型。4.将成功构建的人工皮肤模型随机分为正常组、模型组、预防治疗组、治疗组和对照组。通过日光紫外线模拟器模拟UV(包括UVA及UVB,其中UVA 3J/cm~2,UVB 90mJ/cm~2)照射除正常组外的其余各组人工皮肤以建立人工皮肤光损伤模型。然后将SKPs细胞悬液和Hanks液各25μL在照射结束后分别注入治疗组和对照组,其中预防治疗组在照射前24小时注射25μLSKPs细胞悬液,并于继续培养72小时后收集人工皮肤及培养上清液。5.采用HE染色法观察各组三维人工皮肤中KC和FBs的变化,末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记(TUNEL)法检测皮肤细胞凋亡情况,并计数凋亡指数(Apoptosis Index,AI)。ELISA法检测SKPs或Hanks液注射治疗72小时后各组上清液中丙二醛(Malonaldehyde,MDA)、过氧化氢酶(Hydrogenperoxidase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutas,SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(Glutathione Peroxdas,GSH-Px)的含量,并将结果按组予以统计学分析。结果:1.原代培养的SKPs为悬浮生长,呈大小相近的圆形或椭圆形克隆样细胞球;FBs为贴壁生长,呈梭形、树枝状、旋涡状及放射状;KC为贴壁生长,多角形、铺路石样;将上述细胞分别传至2-3代进行下一步实验。2.免疫组化法显示FBs表达Vimentin和Desmin、KC表达CK19细胞特异性标记,细胞染色均一,胞浆内见棕黄色颗粒,胞核呈蓝色。3.三维人工皮肤肉眼表现为淡乳白色,不透明的皮肤样物。4.HE染色显示:成功构建的皮肤样物(即正常组)类似正常人类皮肤结构,较正常皮肤略薄,由表皮层及真皮层构成;表皮层见3-5层紧密排列的KC,真皮层见均质的淡红色的胶原成分,其间FBs散在分布。而经UV照射后,模型组表皮变薄、细胞肿胀,核浓缩、基底细胞部分液化变性,部分真皮胶原降解且FBs数量明显减少。SKPs移植治疗72小时后,对照组与模型组的组织学差异不显著;而预防治疗组和治疗组人工皮肤厚薄基本均匀一致,KC轻度肿胀,FBs数量轻微减少,未见明显细胞坏死、胶原成分降解。5.TUNEL染色:模型组及对照组均有较多胞核呈棕色,多数为KC,小部分为FBs;而预防治疗组及治疗组表皮与真皮中见少量细胞胞核染色为棕色;正常组极少见细胞胞核染为棕色。模型组和对照组的AI值均明显高于正常组,预防治疗组及治疗组AI值均低于对照组,预防治疗组与治疗组AI值无明显差异。6.SKPs或Hanks液注射治疗72小时后,模型组和对照组上清液MDA水平较正常组明显升高(P<0.05),同时SOD、CAT和GSH-Px水平显著降低(P<0.05)。而预防治疗组及治疗组上清液中MDA水平均低于对照组(P<0.05),SOD、CAT及GSH-Px水平均高于对照组(P<0.05),且治疗组与预防治疗组相比较无统计学差异(P>0.05)。结论:1.SKPs可修复大量UV照射后的三维人工皮肤光损伤模型;2.SKPs可抑制光损伤后细胞的凋亡;3.SKPs修复UV损伤的三维人工皮肤可能是通过减少MDA氧化物生成,促进CAT、GSH-Px、SOD等抗氧化物质表达,进而抑制OS的损伤作用,初步证实SKPs具有对抗OS损伤从而修复光损伤的作用。