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目的:通过对KK-ay糖尿病小鼠在12,18和25周龄时一般糖尿病指标,膀胱功能和结构以及膀胱组织中Myosin Va,SLC17A9,P2X1,M3,M2mRNA表达量的研究,探讨糖尿病膀胱病变的病程发展及其机制。并通过乌药活性成分去甲基异波尔定对KK-ay 小鼠代偿期和失代偿期离体逼尿肌收缩能力作用的研究,来探索其对糖尿病膀胱病变的作用。方法:1.KK-ay小鼠糖尿病膀胱病的病程发展及其膀胱内相关基因的表达量的变化的研究。(1)测定KK-ay小鼠在12,18和25周龄时的体重,饮水量,排尿量,尿频,FBG,OGTT 和 AUC0-2h。(2)测定KK-ay小鼠在12,18和25周龄时尿动力常数,逼尿肌自主收缩幅度,频率和逼尿肌对α,β-methylene ATP,CCh,EFS和KCl刺激的收缩能力,来评价KK-ay 小鼠膀胱功能的变化。(3)在12,18和25周龄时,对KK-ay小鼠膀胱纵切后进行HE和Masson染色,观察膀胱组织结构和形态学的变化。(4)测定KK-ay小鼠在12,18和25周龄时膀胱组织中Myosin Va,SLC17A9,P2X1,M3和M2 mRNA表达量的变化。2.测定不同浓度乌药活性成分去甲基异波尔定(NOR)对小鼠逼尿肌收缩能力的影响,计算半数抑制浓度(IC50)。3.测定乌药活性成分去甲基异波尔定(60 μM)对KK-ay小鼠代偿期(18周龄)逼尿肌对α,β-methylene ATP,CCh,EFS和KCl刺激的收缩能力的影响。4.测定乌药活性成分去甲基异波尔定(10 μM)对KK-ay小鼠失代偿期(25周龄)逼尿肌对α,β-methylene ATP,CCh,EFS和KCl刺激的收缩能力的影响。结果:1.KK-ay小鼠糖尿病膀胱病的病程发展及其膀胱内相关基因的表达量的变化。(1)结果显示,与对照组相比,12,18和25周龄时KK-ay小鼠饮水量,排尿量,排尿频率,FBG,OGTT和AUC0-2h均显著增高(P<0.01或P<0.05)。(2)尿动力结果显示,与对照组小鼠相比,KK-ay小鼠的最大膀胱容量(MBC),残余尿量(RV)和顺应性(BC)在18和25周龄时显著增加(P<0.01或P<0.05);排尿效率(VE)在18和25周龄时显著降低(P<0.01);最大压(MVP)在三个时间点均无显著变化。逼尿肌收缩能力实验显示,与对照组小鼠相比,18周龄KK-ay小鼠逼尿肌自主活动振幅显著增加(P<0.01)且振动频率显著降低(P<0.01),在25周龄时自主收缩的振幅和频率均显著降低(P<0.01或P<0.05);对α,β-methylene ATP刺激在12和18周龄时均显著增加(P<0.01或P<0.05);对CCh的收缩反应在18周龄时显著升高(P<0.01);对EFS刺激KK-ay小鼠18周龄时显著升高(P<0.01),25周龄时显著降低(P<0.01);对KCl刺激的收缩反应25周时显著降低(P<0.01)。(3)组织学结果显示,与对照组小鼠相比,KK-ay小鼠膀胱厚度在12和18周龄时显著增加(P<0.01);肌组织比胶原蛋白的比值在三个时间点均无显著变化;膀胱重在三个时间点均显著增高(P<0.01或P<0.05);膀胱重/体重在12周龄时显著降低(P<0.01),但在25周龄时显著增加(P<0.05)。(4)RT-PCR结果显示,与对照组小鼠相比,KK-ay小鼠膀胱组织在12周龄时Myosin Va表达量显著减少(P<0.05),在18周龄时显著增加(P<0.01);SLC17A9在12周龄时显著减少(P<0.01);P2X1和M2在三个时间点均显著增加(P<0.01或P<0.05);M3受体在12周龄时显著减少(P<0.05),在25周时显著增加(P<0.05)。2.不同浓度乌药活性成分去甲基异波尔定(NOR)对小鼠逼尿肌收缩能力的影响结果。乌药活性成分去甲基异波尔定对逼尿肌的自主收缩幅度和频率无显著影响;高剂量去甲基异波尔定(16,32,64,128 μM)表现出对CCh和EFS刺激的抑制作用(P<0.01 或 P<0.05),IC50为 52.4μM。低剂量去甲基异波尔定(1,3.16,10 μM)(1,2,4,8 μM)对CCh和EFS刺激表现为微弱的增强作用。3.乌药活性成分去甲基异波尔定(60 μM)对KK-ay小鼠代偿期(18周龄)逼尿肌对α,β-methylene ATP,CCh,EFS和KCl刺激的收缩能力的影响结果。乌药活性成分去甲基异波尔定(60 μM)显著抑制了 18周龄KK-ay(代偿期)逼尿肌对α,β-methylene ATP,CCh,EFS和KCl引起的收缩反应(P<0.01或P<0.05)。4.乌药活性成分去甲基异波尔定(10 μM)对KK-ay小鼠失代偿期(25周龄)逼尿肌对α,β-methylene ATP,CCh,EFS和KCl刺激的收缩能力的影响结果。乌药活性成分去甲基异波尔定(10 μM)对25周龄KK-ay(失代偿期)逼尿肌对α,β-methylene ATP,CCh,EFS和KCl引起的收缩反应无显著影响。结论:总之,实验结果显示KK-ay小鼠从12周龄时开始出现了一系列2型糖尿病特征,与临床症状相吻合,表明其是合适的糖尿病动物模型。在随后的病程发展过程中,18周龄的KK-ay小鼠进入了以膀胱过度活动为主要特征的代偿期,25周龄时进入了以膀胱活动减弱为特征的失代偿期。同时还发现糖尿病膀胱的病程发展与神经递质转运蛋白Myosin Va,SLC17A9及突触后膜的嘌呤能受体P2X1受体和胆碱能受体M3,M2 mRNA表达量随时间的变化存在密切的关系,这需要进一步实验探索。乌药活性成分去甲基异波尔定(60 μM)可以显著降低代偿期KK-ay小鼠逼尿肌对嘌呤能,胆碱能,电刺激及KCl刺激引起的收缩反应,而去甲基异波尔定(10μM)对失代偿期KK-ay小鼠逼尿肌收缩能力无显著作用。其作用途径可能是降低逼尿肌收缩能力,也有可能是降低逼尿肌的收缩能力的同时抑制了兴奋性神经递质的传导。这提示乌药活性成分去甲基异波尔定有成为治疗糖尿病膀胱过度活动症药物的前景。