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目的:胆汁淤积性肝病在人群及临床中非常常见,它可由各种原因引起的胆汁生成、分泌和排泄障碍,导致胆汁在肝内淤积,而引起的肝细胞、肝内外胆管一系列器质性损害、代谢失调和功能性异常的肝胆系统疾病。此状态若持续发展将成为肝硬化、肝癌导致死亡。文献报道Pes1在其基序中含有保守的BRCA1 C末端(BRCT)结构域,考虑到此结构域作为响应DNA损伤反应的整合信号模块,Pes1也可能参与DNA损伤和修复,本课题探讨Pes1以及PI3K/AKT/GSK-3β信号通路中的蛋白在胆汁淤积性肝病小鼠中的表达及其对疾病的影响。方法:(1)为探讨胆汁淤积性肝病对小鼠的影响,分别使用0.1%DDC饲料和普通饲料饲喂小鼠4周,比较胆汁淤积性小鼠及正常小鼠体质量的差异。(2)为了解探讨胆汁淤积对小鼠肝脏的影响,取小鼠肝脏用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,做常规病理HE染色,在光学显微镜下观察胆汁淤积性肝病小鼠与正常小鼠组织病理变化。(3)为了解探讨胆汁淤积对小鼠血清的影响,取小鼠血清,按照生化试剂测试盒说明书操作检测胆汁淤积性肝病小鼠与正常小鼠血清中总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的水平。(4)为探讨PES1在胆汁淤积性肝病小鼠肝脏中的表达,采用RT-PCR和Western Blot检测组织中PES1 mRNA和蛋白的表达水平(5)为进一步阐明PES1对PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的影响,提取小鼠肝脏总蛋白,检测PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关蛋白的表达。(6)为选取合适的siRNA来沉默表达小鼠肝细胞AML12的基因PES1,采用RT-PCR和Western Blot来检测用转染试剂敲除小鼠肝细胞AML12中PES1后其mRNA和蛋白的表达高低。(7)为探讨PES1对增值能力的影响,用siRNA沉默小鼠肝细胞AML12中的PES1基因,采用CCK-8实验测定细胞中的增值能力。(8)为探讨沉默小鼠肝细胞AML12中PES1基因对PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的影响,采用Western Blot法检测细胞中PI3K/AKT/GSK-3β及其磷酸化蛋白的蛋白表达水平。结果:(1)与对照组正常C57BL/6小鼠比较,饲喂DDC饲料即胆汁淤积性肝病小鼠体重明显减轻。(2)正常对照组小鼠肝组织结构基本正常,胆管周围基本无炎性细胞,而饲喂DDC饲料小鼠即DDC模型小鼠肝组织中可见汇管区扩大,汇管区以及胆管周围大量炎性细胞浸润,胆管变形以及胆管增生。(3)取小鼠血清检测血清中生化指标水平,与正常对照组C57BL/6相比,胆汁淤积性肝病小鼠血清中总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)水平明显增加。(4)与正常小鼠肝脏相比,饲喂DDC饲料即胆汁淤积性肝病小鼠中PES1 mRNA和蛋白的表达水平下调。(5)与正常小鼠肝脏相比,饲喂DDC饲料即胆汁淤积性肝病小鼠肝脏中总的PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表达水平无明显变化,而p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β蛋白质的表达明显降低。(6)检测siRNA转染小鼠肝细胞AML12后PES1的mRNA和蛋白的表达情况,选用转染效果较好的siRNA-2、siRNA-3小干扰序列来敲除小鼠肝细胞AML12中的PES1用于后续的实验。(7)在CCK-8实验中,小鼠肝细胞在转染24h后,BC组、si-NC组和si-PES1组增殖能力彼此相差不多;但随着转染时间的延长,si-PES1组的增殖能力比BC组和si-NC组逐渐下降;在转染72h后,si-PES1组的增殖能力比BC组和si-NC组明显下降。(8)与正常小鼠肝细胞相比,siRNA转染后的AML12中总的PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表达水平无明显变化,而p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β蛋白质的表达明显降低。结论:(1)胆汁淤积性肝病对小鼠生长发育有影响,对肝细胞有器质性损害。(2)PES1在胆汁淤积性肝病小鼠中低表达,可能在胆汁淤积性肝病中对肝脏起保护作用。(3)PES1促进细胞的增值,可通过PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调节。