锌是动物的必需微量元素,对动物生长具有重要作用。大量的研究表明,锌与动物肠道健康息息相关,缺锌导致动物肠道形态损伤,破坏肠道屏障功能,而补充锌能够通过抑制肠道炎症的发生,降低病原刺激引起的肠道通透性增强。我国是全球肉鸭养殖第一大国,如何在全面禁抗的行业背景下通过营养调控手段改善肉鸭生长性能,维持肉鸭健康状况是动物营养工作者面临的一个重要课题。但现有关于锌对肉鸭生长性能及肠道健康的研究较少,更鲜见锌对肉鸭肠道屏障功能影响的报道,为此本论文开展了三个试验去考察生理及LPS应激条件下锌对肉鸭生长性能和肠道屏障功能的影响,并结合体外培养的鸭原代肠上皮细胞模型研究锌调控肉鸭肠道屏障功能的可能途径。主要内容和结果如下:试验一锌对肉鸭生长性能、肉质、肠道形态及肠道屏障功能相关基因的影响本试验旨在考察饲粮锌水平对肉鸭生长性能、肉质、肠道形态发育以及肠道屏障功能的影响。采用完全随机试验设计,将768只1日龄北京鸭雏鸭分配到6个处理中,每个处理8个重复,每个重复16只鸭。分别饲喂添加不同锌水平（玉米-豆粕型基础饲粮中分别添加0、15、30、60、120、240 mg/kg Zn）的试验饲粮。试验期为35d,分为前期（1-14 d）和后期（15-35 d）两个阶段。结果如下:1)饲粮锌水平显著影响肉鸭生长性能。14和35d时,120、240 mg/kg锌处理组肉鸭体重、日增重均显著高于对照组（P?0.05）。在试验前期和全期60 mg/kg以上锌处理组采食量较对照组显著提高（P?0.05）。在试验后期和全期120、240 mg/kg锌处理组显著降低肉鸭的料肉比（P?0.05）。35 d时,120、240 mg/kg锌处理组较对照组和15 mg/kg锌处理组显著提高了肉鸭胴体重、全净膛重、胸肌重、腿肌重（P?0.05）,但不同处理组的胴体率、全净膛率、胸肌率、腿肌率均无显著差异（P>0.05）。2)饲粮锌水平对宰后45 min胸肌p H值无显著影响（P>0.05）,120、240 mg/kg锌处理组较对照组显著提高了宰后24 h胸肌p H值（P?0.05）。120、240 mg/kg锌处理显著降低了宰后45 min、24 h胸肌亮度（P?0.05）。饲粮锌水平对肉鸭胸肌红度、黄度均无显著影响（P>0.05）。120、240 mg/kg锌处理组较对照组和15 mg/kg处理组胸肌滴水损失、剪切力显著降低（P?0.05）,肌间脂肪含量显著提高（P?0.05）。3)120、240 mg/kg锌处理组肉鸭胸肌中的抗氧化酶SOD、GPX、GR、CAT酶活力以及还原性GSH的含量显著提高（P?0.05）。120、240 mg/kg锌处理组较对照组和15 mg/kg锌处理组显著降低了胸肌中脂质过氧化产物（MDA）的含量（P?0.05）。实时荧光定量PCR结果也表明饲粮中添加120、240 mg/kg的锌能够显著提高肉鸭胸肌中SOD、GPX、GR、CAT以及Nrf2基因的表达（P?0.05）。4)随着饲粮锌水平的升高,肉鸭各组织中锌含量随之提高。120、240 mg/kg锌处理组胸肌、血液中的锌含量显著高于对照组（P?0.05）;肝脏和胫骨中的锌含量显著高于对照组和15 mg/kg锌处理组（P?0.05）。5)在14和35 d时,120、240 mg/kg锌处理组空肠绒毛高度显著高于对照组（P?0.05）。14 d时,120、240 mg/kg锌处理组空肠隐窝深度显著低于对照组（P?0.05）,绒隐比显著高于对照组（P?0.05）。6)在14和35 d时,120、240 mg/kg锌处理组空肠紧密连接蛋白基因CLDN-1、OCLD、ZO-1、ZO-3的表达均显著高于其他处理组（P?0.05）;对照组渗漏蛋白CLDN-2的基因表达显著高于其他处理组（P?0.05）。补充120、240 mg/kg的锌显著提高了14和35 d肉鸭空肠化学屏障相关基因MUC2和TFF2的表达（P?0.05）,也提高了免疫屏障相关基因Ig A、p Ig R、LYZ、Av BD2的表达（P?0.05）。结果表明,饲粮中补充锌显著提高肉鸭生长性能、改善胴体品质和肉质,提高组织锌含量。肉鸭生产性能提高的原因可能是锌促进了肠道形态发育。饲粮中补充锌能够提高肉鸭肠道物理屏障、化学屏障、免疫屏障相关基因的表达,对肠道屏障功能具有促进作用。根据折线回归分析,获得最佳1-35 d平均日增重、料肉比的适宜锌添加水平分别为105.63、121.5 mg/kg。试验二锌对LPS应激肉鸭肠道屏障功能的保护作用本试验旨在考察LPS应激条件下,锌对肉鸭肠道屏障功能的保护作用及可能的作用机理。试验选用480只1 d雄性北京鸭雏鸭,随机分配到6个处理中,每个处理8个重复,每个重复10只鸭。按照3×2两因子完全随机试验设计,设置低锌、正常锌、高锌（玉米-豆粕型基础饲粮中添加0、30、120 mg/kg Zn）3个锌水平以及LPS应激与否。在试验第15、17、19、21 d进行LPS腹腔注射,第21 d灌服FITC-D检测肠道通透性。试验结果如下:1)LPS应激显著降低了肉鸭21 d体重、应激期体增重和采食量（P?0.05）。高锌处理组能够显著提高肉鸭体重、应激期体增重（P?0.05）。饲粮锌水平和LPS应激对肉鸭体重、应激期体增重具有交互作用,高锌处理能够缓解LPS应激引起21 d肉鸭体重降低（P?0.05）,并有缓解体增重降低的趋势（P=0.057）。2)LPS应激能够显著降低空肠绒毛高度和绒隐比（P?0.05）,提高隐窝深度（P?0.05）。高锌处理能够显著提高肉鸭空肠绒毛高度和绒隐比,并显著降低隐窝深度（P?0.05）。锌水平和LPS应激对肉鸭空肠绒毛高度、隐窝深度、绒隐比具有显著的交互作用,高锌处理能够显著提高LPS应激条件下的绒毛高度、绒隐比并降低绒隐窝深度（P?0.05）。3)LPS应激显著降低肉鸭空肠麦芽糖酶、AKP、Na⁺-K⁺-ATPase的活力（P?0.05）,并显著提高空肠MUC2含量（P?0.05）。高锌处理显著提高肉鸭空肠AKP、Na⁺-K⁺-ATPase活力和MUC2含量（P?0.05）。锌水平和LPS应激对肉鸭空肠AKP、Na⁺-K⁺-ATPase有显著交互作用,补充锌能够缓解LPS引起的AKP活力下降（P?0.05）。4)LPS应激显著提高了肉鸭血清中肠道通透性标记分子的FITC-D和D-乳酸的浓度（P?0.05）。高锌处理显著降低了血清中FITC-D和D-乳酸的浓度（P?0.05）。饲粮锌水平和LPS应激对血清FITC-D和D-乳酸浓度具有显著交互作用,高锌处理能够缓解LPS引起的血清FITC-D和D-乳酸浓度提高（P?0.05）。5)LPS应激引起肉鸭空肠CLDN-1、ZO-1、ZO-3、EPCAM、JAM2 m RNA水平的显著降低,并显著提高CLDN-2、MLCK基因的表达（P?0.05）。补充锌显著提高空肠中紧密连接相关基因CLDN-1、OCLD、ZO-1、ZO-3的表达,降低了CLDN-2和MLCK的表达（P?0.05）。锌水平与LPS应激对空肠CLDN-1、ZO-1、MLCK的表达具有显著交互作用,补充锌能够缓解在LPS应激条件下鸭空肠CLDN-1表达的降低和MLCK表达的升高（P?0.05）。6)LPS应激显著提高了肉鸭空肠促炎因子IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、INF-γ、TNF-α、TLR4、i NOS以及凋亡相关基因caspase-3和8的表达（P?0.05）。高锌处理显著降低了IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、TLR4、i NOS、caspase-3和caspase-8的表达（P?0.05）,并提高了IL-10的表达（P?0.05）。锌水平和LPS应激对肉鸭空肠IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、INF-γ、TNF-α、TLR4、i NOS及caspase-3、caspase-8等基因的表达具有显著交互作用。LPS应激条件下,高锌处理显著缓解了肉鸭空肠中IL-2、IL-6、IL-8、INF-α、TNF-α、TLR4、i NOS、caspase-3、caspase-8等基因的表达,并促进了IL-10基因的表达（P?0.05）。7)LPS应激显著降低了肉鸭空肠吸收型肠细胞标记分子AKP、Villin的m RNA水平（P?0.05）;显著提高了分泌型细胞标记分子MUC2、LYZ、Sox9和干细胞标记分子Lgr5、Bmi1、Dll1、Tert的表达（P?0.05）。高锌处理显著提高了AKP、Villin、MUC2、LYZ、Sox9的m RNA水平（P?0.05）。饲粮锌水平和LPS应激对肉鸭空肠AKP、Lgr5、MUC2、LYZ、Bmi1、Tert、β-catenin等基因的表达具有显著交互作用,LPS应激条件下,高锌处理显著提高了AKP、MUC2、LYZ、Sox9 m RNA的水平（P?0.05）,减少了LPS应激条件下的Lgr5、Bmi1、Tert表达的增加（P?0.05）。结果表明,补充锌可能通过缓解LPS引起的肠道炎症因子的表达,缓解LPS引起的肠道形态、消化酶活力、以及肠道屏障功能的损伤,从而提高LPS应激条件下的肉鸭生长性能。肠道上皮能够通过动员肠道干细胞向分泌型肠上皮细胞的分化,修复LPS引起的肠道上皮细胞形态和肠道屏障功能损伤,锌能够维持肠道上皮结构和功能,减少LPS引起的肠道干细胞动员。试验三锌对LPS应激鸭原代肠上皮细胞屏障功能的保护作用及其机制（一）鸭原代肠上皮细胞的分离培养与鉴定为了深入考察锌对肉鸭肠道上皮细胞屏障功能的保护作用及其机制,本试验拟通过酶消化法分离鸭原代肠道上皮细胞（duck intestinal epithelial cells,DIECs）,对分离得到的鸭原代肠上皮细胞进行传代培养,并对其肠上皮细胞特征和功能特征进行鉴定,以期为后续试验提供研究模型。结果如下:1)鸭胚小肠组织块经胶原蛋白酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅱ消化,可以分离得到大量能够贴壁生长的细胞团。DIECs从细胞团上爬出贴壁生长,形成连接紧密、边界清晰、呈现“铺路石”样形态的单细胞层。细胞增殖实验表明,DIECs能进行有限的传代,但细胞中增殖活力随传代次数显著降低,并且细胞体积变大形状拉长。2)免疫荧光染色显示,紧密连接蛋白ZO-1、CLDN-1在DIECs细胞边界间表达,呈现典型的“蜂窝状”结构。扫描电镜下,观察DIECs顶膜上分布着大量的微绒毛;透射电镜下,观察到细胞之间形成完整的紧密连接和桥粒等结构。DIECs能够表达各种肠上皮细胞特异性基因。通过流式细胞分析,90.3%的DIECs表达肠上皮细胞标记分子CK-18。3)DIECs具有AKP和Na⁺-K⁺-ATPase的活力,但随着传代次数的增加逐渐降低（P?0.05）。接种于Transwell嵌套杯中的P₁代DIECs所形成单细胞层,能表现出较大的跨膜电阻（≈4000?/cm²）。结果表明,本试验成功分离得到了较纯的鸭原代肠上皮细胞,DIECs具有典型的肠上皮细胞形态特征和超微结构,能够表达肠道上皮细胞标记分子,具备一定的消化酶活力和跨膜电阻等功能,上述特征表明DIECs可以作为研究模型用于后续研究。（二）锌对LPS应激鸭原代肠上皮细胞屏障功能的保护作用及其机制本实验旨在考察LPS应激条件下,不同锌水平对DIECs屏障功能的保护作用及其机制。本试验以P₁代DIECs为试验对象,采用3×2两因子随机试验设计,设置3个锌水平（缺锌（2μmol/L TPEN,锌离子螯合剂）、正常锌（对照）、高锌（20μmol/L Zn））以及20μg/m L LPS应激与否共六个处理。结果如下:1)锌水平处理24 h对DIECs跨膜电阻（TEER）有显著影响,缺锌组TEER值显著低于适宜锌和高锌组（P?0.05）。经LPS处理4 h后,DIECs TEER值显著降低（P?0.05）。锌水平与LPS处理对DIECs TEER值具有交互作用,补充锌能缓解LPS应激引起的TEER降低（P?0.05）。LPS处理8 h后,锌水平与LPS处理对DIECs TEER和FITC-D通透性具有显著交互作用,锌水平的提高能够缓解LPS应激引起的TEER降低和FITC-D通透性增加,表现为低锌处理能加重LPS应激引起的DIECs TEER降低和FITC-D通透性增加,而高锌处理能够缓解LPS应激引起的TEER降低和FITC-D通透性增强（P?0.05）。2)LPS处理显著降低DIECs紧密连接蛋白CLDN-1、OCLD、ZO-1、ZO-3、EPCAM、JAM2等基因的表达（P?0.05）,显著提高了CLDN-2、MLCK m RNA水平（P?0.05）。高锌处理显著提高了DIECs CLDN-1、OCLD、ZO-1、ZO-3、EPCAM、JAM2等基因的表达（P?0.05）,显著降低了CLDN-2、MLCK基因的表达（P?0.05）。锌水平和LPS应激对CLDN-1、OCLD、ZO-1、MLCK等基因的表达具有交互作用,高锌处理缓解了LPS应激条件下CLDN-1、OCLD、ZO-1表达的降低,并降低了MLCK表达（P?0.05）。Western blot结果也证实,LPS能够显著降低CLDN-1、OCLD、ZO-1蛋白表达（P?0.05）。高水平的锌能够促进紧密连接蛋白CLDN-1、OCLD、ZO-1蛋白的表达（P?0.05）。锌和LPS应激对紧密连接蛋白的表达具有显著交互作用,添加锌能够提升LPS引起的DIECs OCLD、ZO-1蛋白表达的降低（P?0.05）。3)LPS应激显著提高了DIECs促炎因子IL-2、IL-6、IL-8、INF-γ、TNF-α、TLR4和抗炎因子IL-10的基因表达（P?0.05）。高锌显著降低了IL-2、IL-6、IL-8、INF-γ、TNF-α、TLR4等基因的表达（P?0.05）,显著提高了IL-10的表达（P?0.05）。锌水平和LPS应激对IL-2、IL-10、INF-γ、TNF-α、TLR4的表达具有交互作用,高锌处理降低了LPS应激引起的IL-2、INF-γ、TNF-α、TLR4的表达升高（P?0.05）,促进IL-10基因表达的提高（P?0.05）。4)LPS应激显著提高了DIECs caspase-3、caspase-8、BAX、A20、i NOS、MT m RNA水平（P?0.05）。锌水平提高显著降低了DIECs caspase-3、caspase-8、BAX、i NOS等凋亡相关基因的表达（P?0.05）,增强了A20、MT等细胞保护基因的表达（P?0.05）。锌水平和LPS应激对caspase-3、A20、i NOS、MT等基因的表达具有交互作用,锌水平的提高降低了LPS诱导的caspase-3、i NOS的表达,促进了LPS诱导的DIECs A20、MT的表达（P?0.05）。Western blot结果显示LPS能够显著降低蛋白质合成调节分子TOR蛋白的磷酸化水平（P?0.05）,而锌水平的提高能够促进DIECs TOR蛋白磷酸化水平（P?0.05）。锌水平和LPS应激对TOR蛋白磷酸化水平具有交互作用。补充锌可以缓解LPS应激条件下TOR蛋白磷酸化水平的降低（P?0.05）。5)LPS处理显著降低了DIECs AKP、Na⁺-K⁺-ATPase的活力（P?0.05）。补充锌显著提高了DIECs AKP、Na⁺-K⁺-ATPase的活力（P?0.05）。锌水平与LPS处理对DIECs Na⁺-K⁺-ATPase酶活具有显著交互作用,高锌处理显著缓解了LPS应激DIECs引起的Na⁺-K⁺-ATPase活力降低（P?0.05）,并有提高AKP酶活力的趋势（P=0.072）。结果表明,高锌处理减少了LPS引起炎症因子相关的表达,缓解了凋亡相关基因的表达,促进细胞保护基因的表达,促进了TOR的磷酸化水平,维持了DIECs的紧密连接蛋白m RNA与蛋白的表达,缓解LPS引起的DIECs屏障功能受损和通透性增加。综上所述,饲粮中补充锌能提高肉鸭的生长性能、改善肠道形态,提高消化酶活、增强肠道屏障功相关基因的表达。以生产性能为指标,1-35 d肉鸭饲粮适宜锌添加水平为121.5 mg/kg。饲粮中补充锌能够缓解LPS应激引起肉鸭生产性能降低和肠道屏障功能的破坏,这是由于锌缓解了LPS诱导炎性因子对上皮细胞紧密连接相关基因表达的破坏,减少炎性因子引起的细胞凋亡,缓解肠道干细胞的动员。在鸭原代肠上皮细胞上的研究也证明,锌能够缓解LPS引起的肠道屏障功能损伤、减少LPS诱导炎性因子的表达、促进细胞保护基因的表达,维持TOR信号通路激活状态以及促进肠道紧密连接蛋白的合成。