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RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在转录后水平有效沉默特异性基因的表达,是生物遗传控制网络中的重要通路之一,已被广泛用于肿瘤的治疗研究。人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor, hEGFR)在多种肿瘤细胞中过度表达,参与肿瘤形成发展的多个过程,是治疗肿瘤的重要靶点之一。本研究鉴于RNAi的多项优势以及hEGFR作为肿瘤靶点的潜在应用价值,以RNAi作为降低hEGFR基因表达的途径,探讨其对人类肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制作用。靶向hEGFR的单基因沉默载体为pRS-EGFR系列载体,阴性对照为Rs1。我们将以上载体瞬时转染至人类肝癌细胞SMMC-7721,通过RT-PCR实验研究了hEGFR基因的表达情况；同时我们对转染单基因沉默载体的肝癌细胞进行了稳定筛选,2周左右得到稳定表达细胞株,对其进行了RT-PCR和MTT实验。结果表明,与阴性对照组相比,瞬时转染和稳定表达重组质粒pRS-EGFR-sh的SMMC-7721肝癌细胞中hEGFR的mRNA相对表达量分别下降了48%、46%、13%、5%和51%、44%、21%、10%；MTT实验结果显示：稳定表达RNAi载体的肝癌细胞生长速度受到不同程度的抑制。这提示我们,RNAi的影响因素是多方面而且未知的,随着分子生物各项技术和基因组学的发展,RNAi有待于更深入的研究和完善。肿肿瘤的发病涉及到多个信号通路,它们相互联系、相互作用,组成一个分子网络体系,因此针对单个靶点进行抗肿瘤治疗很有可能收效甚微。肿瘤的多靶点治疗可以从多方面阻滞癌细胞增殖,符合肿瘤的发病规律和治病要求,是抗肿瘤治疗的发展趋势。hTERT (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)作为端粒酶活性的限制组分,在多种肿瘤细胞中表达显著增强,是抗肿瘤治疗的另一理想靶点。有文献报道,EGFR过度表达可以激活端粒酶活性,阻断EGFR信号通路后,会伴随有端粒酶活性的下降以及TERT表达减弱。本研究根据EGFR与TERT之间的密切联系,以及肿瘤多靶点治疗的重要意义,将靶向hEGFR和hTERT的shRNA构建至同一pRS载体,即RNA干扰双基因表达载体,以达到多方位、低耐药、高力度抗肿瘤的目的。以hTERT为作用靶点的RNA干扰载体分别命名为为shRNA-T系列载体。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pRS-EGFR-sh载体,回收含有hEGFR-shRNA序列的小片段,并将其小片段插入shRNA-T系列载体的EcoRⅠ位点,构建同时表达hTERT-shRNA和hEGFR-shRNA的双基因RNA干扰载体。电泳图谱结果呈现预期的DNA条带,说明双基因RNA干扰载体构建成功。